史春虹，姜一農(nóng)，單路娟，路 巖，張 英，高彥國

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬一院內(nèi)分泌科，2.心內(nèi)科，3.中心實驗室，遼寧大連116011；4.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院，遼寧 大連116011）

氧化應(yīng)激在多種疾病的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的基本原因。晚期氧化蛋白產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物，在動脈粥樣硬化性心血管疾病患者體內(nèi)明顯升高［1］，研究顯示［2，3］，晚期氧化蛋白產(chǎn)物可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等動脈粥樣硬化相關(guān)的細(xì)胞成分分泌多種炎癥因子，新近研究表明［4］，晚期氧化蛋白產(chǎn)物還能抑制膽固醇從巨噬細(xì)胞外流，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，參與動脈粥樣硬化的進(jìn)展，但是具體機制仍未有定論?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1α可趨化單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附進(jìn)而進(jìn)入血管壁，而這一過程是動脈粥樣硬化病灶形成的主要環(huán)節(jié)，目前國內(nèi)尚無關(guān)于晚期氧化蛋白產(chǎn)物對基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α作用的研究，本文探討晚期氧化蛋白產(chǎn)物對ECV304細(xì)胞分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α的影響以及可能的信號通路，以期對氧化應(yīng)激促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)病機制尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ECV304細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）抗體購自博士德公司，Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0購自大連寶生物公司，p-ERK1／2抗體購自 Santa Cruz，U0126購自 Sigma，SDF-lα定量酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海森雄公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5%CO2，濕潤的恒溫孵箱中。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%～90%時，以0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA溶液消化，按1∶5傳代。取第3～5代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。實驗前細(xì)胞均經(jīng)過12 h無血清培養(yǎng)，實驗過程中設(shè)復(fù)孔，常規(guī)以臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞死亡率，各組細(xì)胞死亡率均≤5%。

1.3 AOPP-BSA的制備及濃度測定

200mg／ml牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與 0.2 mol／L NaOCl各取等量混合，室溫孵育30 min，4℃以 0.01 mol／L PBS（pH 7.4）透析 24 h，0.22μm硝酸纖維素膜過濾消毒，-70℃凍存。以經(jīng)同樣處理但未加NaOCl的BSA作對照。AOPP的測定應(yīng)用分光光度法，酸性條件340 nm測AOPP-BSA濃度，以氯胺-T為標(biāo)準(zhǔn)品，實際測定的為AOPP對氯胺-T的相對濃度。

1.4 RT-PCR法檢測 ECV304細(xì)胞 SDF-1αmRNA的表達(dá)

將ECV304細(xì)胞接種于6孔板，待長成單層后移去普通 RPMI 1640培養(yǎng)液，加入含有200μmol／L BSA，0，50，100，200μmol／L AOPP-BSA的 RPMI 1640培養(yǎng)液孵育6 h后收集細(xì)胞。加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用 Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0試劑盒，以 GAPDH為內(nèi)對照，SDF-1α擴增產(chǎn)物全長495 bp，上游引物5’-AAGCCCGTCAGCCTG AGC TAC-3’，下游引物 5’-AGT TAT CTA CAT CTT GAA CCTCT-3’GAPDH擴增產(chǎn)物全長697 bp，上游引物 5’-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3’，下游引物 5’-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3’。反應(yīng)條件：94℃變性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1min，共28個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠成像系統(tǒng)采集電泳結(jié)果，并應(yīng)用附帶軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度值之比，進(jìn)行半定量PCR。

1.5 Western blot法檢測 ECV304細(xì)胞 SDF-1α及p-ERK1／2蛋白水平

將ECV304細(xì)胞接種于6孔板，待長成單層后移去普通 RPMI 1640培養(yǎng)液，加入含有200μmol／L BSA，0，50，100，200μmol／L AOPP-BSA的 RPMI 1640培養(yǎng)液孵育 24 h，或者 15 min，或者含 200 μmol／L AOPP-BSA的 RPMI 1640培養(yǎng)液孵育 0、15、30、60、120min后收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，冰 PBS漂洗細(xì)胞 3次，加入 100μl細(xì)胞裂解緩沖液，4℃12 000 r／min離心10min，取上清。采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白上樣量為每孔32μg，以10%分離膠100 V恒壓電泳，4℃200mA電轉(zhuǎn)移1.5 h至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉過夜，以1∶1 000封閉液稀釋一抗，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶800，室溫下孵育 2 h，以 1∶5 000封閉液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光法顯像，UVP凝膠圖像處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測ECV304細(xì)胞上清液中SDF-1α水平

將ECV304細(xì)胞接種于12孔板，待長成單層后移去普通 RPMI 1640培養(yǎng)液，分別與含0.1，1，10 μmol／LU0126的培養(yǎng)基孵育1 h，之后吸出上述培養(yǎng)基，以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，再加入含200 μmol／L AOPP-BSA的 RPMI1640培養(yǎng)液孵育24 h，收集上清液。按照試劑盒說明書操作，在492 nm處測吸光度值。以統(tǒng)計軟件SPSS 13.0擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 AOPP-BSA對 ECV304細(xì)胞 SDF-1αmRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，BSA組SDF-1αmRNA表達(dá)量升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，不同濃度（50μmol／L，100 μmol／L，200μmol／L）的 AOPP-BSA均顯著升高 SDF-1αmRNA的表達(dá)（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。與 50μmol／L AOPP-BSA組比較，100μmol／L及 200μmol／L AOPP-BSA組 SDF-1αmRNA的表達(dá)量升高（P均＜0.01）。200μmol／L AOPP-BSA組比 100 μmol／L AOPP-BSA組 SDF-1αmRNA的表達(dá)量升高（P＜0.05，圖 1，表 1）。

Fig.1 Effects of AOPP on SDF-1αmRNA expression in ECV304 cells by dose dependentmanner

Tab.1 Effects of AOPP on SDF-1αmRNA and protein expression in ECV304 cells（±s，n＝3）

Tab.1 Effects of AOPP on SDF-1αmRNA and protein expression in ECV304 cells（±s，n＝3）

SDF-1α：Stromal cell-derived factor-1α；AOPP：Advanced oxidation protein products；BSA：Bovine serum albumin*P＜0.05，**P＜0.01 vs control； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 50μmol／L AOPP-BSA；△P＜0.05 vs 100μmol／L AOPP-BSA

Group SDF-1αmRNA／GAPDHmRNA SDF-1αproten／β-actin protein Control 0.035±0.010 0.214±0.040 200μmol／L BSA 0.043±0.009 0.197±0.052 50μmol／L AOPP-BSA 0.116±0.024* 0.604±0.088*100μmol／L AOPP-BSA 0.259±0.086**＃＃ 0.996±0.083**＃200μmol／L AOPP-BSA 0.330±0.058**＃?！?1.108±0.124**＃

2.2 AOPP-BSA對ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α蛋白水平的影響

與對照組比較，BSA組 SDF-1α蛋白表達(dá)量升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，不同濃度（50μmol／L，100 μmol／L，200μmol／L）的 AOPP-BSA顯著升高 SDF-1α蛋白的表達(dá)（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。與 50μmol／L AOPP-BSA組比較，100μmol／L及 200 μmol／LAOPP-BSA組 SDF-1α蛋白的表達(dá)量升高（P均 ＜0.05）。200μmol／L AOPP-BSA組比 100μmol／L AOPP-BSA組SDF-1αmRNA的表達(dá)量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，表1）。

2.3 AOPP-BSA對 ECV304細(xì)胞 p-ERK1／2蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，BSA組ECV304細(xì)胞ERK1／2蛋白磷酸化水平下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義，不同濃度（50 μmol／L，100μmol／L，200μmol／L）的 AOPP-BSA顯著升高ERK1／2蛋白磷酸化水平（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。與 50μmol／L AOPP-BSA組比較，100μmol／L及 200μmol／LAOPP-BSA組 ERK1／2蛋白磷酸化水平升高（P均 ＜0.01）。200μmol／L AOPP-BSA組比 100μmol／L AOPP-BSA組 ERK1／2蛋白磷酸化水平升高（P＜0.01，圖 3，表 2）。

200μmol／L AOPP-BSA刺激 15 min后 ERK1／2磷酸化蛋白量與對照組相比顯著升高（P＜0.01），之后逐漸下降，120 min ERK1／2磷酸化蛋白量與對照組相比仍處于較高水平（P＜0.05）。AOPP-BSA以時間依賴的方式調(diào)節(jié)ERK1／2蛋白磷酸化活性（圖 3，表 3）。

Fig.2 Effects of AOPP on SDF-1αprotein expression in ECV304 cells by dose dependentmanner

Fig.3 Effects of AOPP on pERK1／2 protein expression in ECV304 cells by dose and time dependentmanner

Tab.2 Effects of AOPP on pERK1／2 protein expression in ECV304 cells by dose-dependentmanner（±s，n＝3）

Tab.2 Effects of AOPP on pERK1／2 protein expression in ECV304 cells by dose-dependentmanner（±s，n＝3）

AOPP：Advanced oxidation protein products；BSA：Bovine serum albumin*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs 50μmol／L AOPP-BSA；△△P＜0.01 vs 100μmol／L AOPP-BSA

Group pERK1／2 protein／β-actin protein Control 0.216±0.035 200μmol／L BSA 0.167±0.041 50μmol／L AOPP-BSA 0.308±0.076*100μmol／L AOPP-BSA 0.490±0.083**＃＃200μmol／L AOPP-BSA 0.798±0.095**＃?！鳌?/p>

Tab.3 Effects of AOPP on pERK1／2 protein expression in ECV304 cells by time-dependentmanner（±s，n＝3）

Tab.3 Effects of AOPP on pERK1／2 protein expression in ECV304 cells by time-dependentmanner（±s，n＝3）

AOPP：Advanced oxidation protein products*P＜0.05，**P＜0.01 vs control； ＃＃P＜0.01 vs 15 min；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 30min

Group pERK1／2 protein／β-actin protein 0min（Control） 0.086±0.009 15min 0.801±0.096**30min 0.310±0.082**＃＃60min 0.235±0.037**＃＃△120min 0.152±0.024*＃?！鳌?/p>

2.4 ERK1／2選擇性抑制劑U0126抑制AOPP-BSA對ECV304細(xì)胞SDF-1α蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用

與對照組比較，AOPP-BSA可顯著升高ECV304細(xì)胞 SDF-1α蛋白的表達(dá)（P＜0.01），與 AOPP-BSA組相比較，0.1μmol／LU0126使 AOPP-BSA作用下的SDF-1α蛋白表達(dá)量減少，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。1μmol／LU0126使 SDF-1α蛋白表達(dá)量進(jìn)一步減少（P＜0.05），10μmol／L U0126顯著降低 SDF-1α蛋白的表達(dá)（P＜0.01，表 4）。

Tab.4 Effects of U0126 of different concentrations on SDF-1αexpression in ECV304 cells after AOPP-BSA stimulating（±s，n＝3）

Tab.4 Effects of U0126 of different concentrations on SDF-1αexpression in ECV304 cells after AOPP-BSA stimulating（±s，n＝3）

ECV304 cellswere pretreated with U0126 of different concentrations for 1 hour，then were treated with 200μmol／L AOPP-BSA for 24 hours，to detect the levels of SDF-1α in supernatant by ELISA.AOPP：Advanced oxidation protein products；BSA：Bovine serum albumin**P＜0.01 vs control； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AOPPBSA

Group SDF-1α（ng／ml ）Control 317.14±56.82 AOPP-BSA 792.43±67.59**AOPP-BSA＋0.1μmol／LU0126 650.04±71.33 AOPP-BSA＋1μmol／LU0126 532.26±64.76＃AOPP-BSA＋10μmol／LU0126 379.20±70.68＃＃

3 討論

晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）由 Witko-sarsat于 1996年首次在尿毒癥患者血漿中發(fā)現(xiàn)，是活化的中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶生成的次氯酸攻擊蛋白質(zhì)氨基酸殘基形成的各種氧化蛋白產(chǎn)物的總稱，在體外用次氯酸或者次氯酸鹽氧化人血清白蛋白可得到與體內(nèi)類似的產(chǎn)物［5］。AOPP既是氧化應(yīng)激標(biāo)志物，還作為促炎癥因子在多種病理生理過程中起到重要作用，Qiu GZ等［3］證實AOPP修飾蛋白可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞腫瘤壞死因子α以及白介素6 mRNA和蛋白的表達(dá)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射AOPP增加了糖尿病大鼠腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤，上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）在腎臟的表達(dá)［6］。SDF-1α是一種趨化因子，可趨化T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁［7］，研究證實，SDF-1α在人動脈粥樣硬化斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)［8］，與MCP-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1（macrophage inflammatory protein-1，MIP-1）比較，其對T細(xì)胞的趨化活性高10倍。本研究探討AOPP-BSA對ECV304細(xì)胞SDF-1αmRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示AOPPBSA可顯著增加ECV304細(xì)胞SDF-1αmRNA及蛋白的表達(dá)，呈濃度依賴性。已知SDF-1α是一種高效的細(xì)胞趨化因子，而趨化因子在炎癥反應(yīng)中的免疫細(xì)胞遷移和定位過程中起到重要作用，所以本研究結(jié)果再次證實AOPP具有促炎癥作用。

多個試驗表明AOPP在動脈粥樣硬化性心血管疾病中起重要作用［2，4，9］。本實驗結(jié)果顯示 AOPPBSA呈濃度依賴性地增強趨化因子SDF-1αmRNA和蛋白在ECV304細(xì)胞的表達(dá)，50μmol／l AOPP-BSA與ECV304細(xì)胞作用后，SDF-1αmRNA和蛋白的表達(dá)與對照組比較既有顯著升高，隨著AOPP濃度增加，SDF-1αmRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行性升高。眾所周知，動脈粥樣硬化以慢性炎癥為主要特征，結(jié)果說明AOPP與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本研究證實AOPP促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)，可能是其參與動脈粥樣硬化的途徑之一。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路（Ras→Raf→ MEK1／2→ ERK1／2）是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，普遍認(rèn)為ERK1／2通路活化介導(dǎo)細(xì)胞的增殖效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)ERK通路還參與應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細(xì)胞反應(yīng)，表明ERK1／2通路的激活與炎癥反應(yīng)也有著密切關(guān)系［10］。本研究也證實具有促炎癥作用的氧化蛋白產(chǎn)物AOPP-BSA能夠激活ERK1／2通路，并且表現(xiàn)出濃度和時間依賴性，隨著AOPPBSA濃度的增加，磷酸化 ERK1／2蛋白量增加，AOPP-BSA刺激15 min后ERK1／2磷酸化水平就顯著升高，之后逐漸下降，120 min時仍明顯高于對照組。另外，AOPP-BSA刺激后內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) SDF-1α增加，這一作用可被ERK1／2特異性阻斷劑 U0126抑制，0.1μmol／L，1μmol／L，10μmol／L的抑制劑對AOPP-BSA處理后SDF-1α表達(dá)量的抑制逐漸增強，上述實驗結(jié)果表明AOPP-BSA促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α表達(dá)的信號通過細(xì)胞內(nèi)ERK1／2通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上，AOPP促進(jìn) ECV304細(xì)胞 SDF-1α的表達(dá)，具有促炎癥作用，可能是氧化應(yīng)激促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)病機制的途徑之一。這一作用通過ERK通路介導(dǎo)，針對ERK為靶點的阻斷治療是否能夠減緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展尚需進(jìn)一步研究。

［1］ Skvarilova M，Bulava A，Stejskal D，et al.Increased level of advanced oxidation protein products（AOPP）as amarker of oxidative stress in patients with acute coronary syndrome［J］.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2005，149（1）：83-87.

［2］ Guo Z J，Niu H X，Hou F F，et al.Advanced oxidation protein products activate vascular endothelial cellsviaa RAGE-mediated signaling pathway［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10（10）：1699-1712.

［3］ Zhou Q G，Zhou M，Lou A J，et al.Advanced oxidation protein products induce inflammatory response and insulin resistance in cultured adipocytesviainduction of endoplasmic reticulum stress［J］.Cell physiol biochem，2010，26（4-5）：775-786.

［4］ Mo ZC，Xiao J，Liu H X，etal.AOPPs inhibits cholesterol efflux by down-regulating ABCA1 expression in a JAK／STAT signaling pathway-dependent manner［J］.J Atheroscler Thromb，2011，18（9）：796-807.

［5］ Witko-Sarsat V，F(xiàn)riedlanderM，Capeillere-Blandin C，etal.Advanced oxidation protein products as a novelmarker of oxidative stress in uremia［J］.Kidney Int，1996，49（5）：1304-1313.

［6］ Shi X Y，Hou F F，Niu H X，et al.Advanced oxidation protein products promote inflammation in diabetic kidney through activation of renal nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase［J］.Endocrin，2008，149（4）：1829-1839.

［7］ Zeiffer U，Schober A，Lietz M，et al.Neointimal smooth muscle cells display a proinflammatory phenotype resulting in increased leukocyte recruitment mediated by P-selectin and chemokines［J］.Circ Res，2004，94（6）：776-784.

［8］ WeiD，Wand G，Tang C，et al.Upregulation of SDF-1 is associated with atherosclerosis lesions induced by LDL concentration polarization［J］.Ann Biomed Eng，2012，40（5）：1018-1027.

［9］ Guo Z J，Hou F F，Liu SX，et al.Picrorhiza scrophulariiflora improvesaccelerated atherosclerosis through inhibition of redox-sensitive inflammation［J］.Int J Cardiol，2009，136（3）：315-324.

［10］ Chu X，Ci X，He J，et al.A novel anti-inflammatory role for ginkgolide B in asthmaviainhibition of the ERK／MAPK signaling pathway［J］.Molecules，2011，16（9）：7634-7648.