陶 新 徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

miRNAs是一類長(zhǎng)約18～26 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，作為細(xì)胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，影響著機(jī)體內(nèi)部幾乎所有的信號(hào)通路。它是體內(nèi)最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，可調(diào)控機(jī)體內(nèi)超過(guò)1/3蛋白編碼基因的表達(dá)，在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。miRNAs參與了干細(xì)胞的自我更新和多向分化[1]，與免疫、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌和心血管等系統(tǒng)的發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。miRNAs的表達(dá)模式具有時(shí)序性和組織特異性，但大多數(shù)的miRNAs在相關(guān)物種間又高度保守，提示它們?cè)陉P(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程如應(yīng)激適應(yīng)能力和激素信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用[2]。目前有關(guān)miRNAs在腸道組織中的報(bào)道主要集中在其差異性表達(dá)與結(jié)直腸癌[3-5]、炎癥性腸病(IBD)[6]、腸易激綜合征(IBS)[7]和囊性纖維化(CF)[8]等腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系的研究。然而越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，miRNAs的表達(dá)同樣對(duì)腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)的發(fā)育進(jìn)程、正常維持以及腸道各種功能的發(fā)揮等起著重要調(diào)控作用。因此，全面而深入地了解miRNAs在腸道組織中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)理，對(duì)于深層次挖掘和揭示影響機(jī)體腸道健康的分子機(jī)理具有非常重要的科學(xué)意義。

1 miRNAs在腸道組織中的表達(dá)

miRNAs在腸道組織中的種類和表達(dá)均較為豐富。其中，在人類腸道中的表達(dá)多來(lái)自對(duì)腸道成熟細(xì)胞系的研究結(jié)果。Cummins等[9]通過(guò)利用miRNA基因表達(dá)系列分析技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、DLD1、RKO、Caco-2 和 SW480 等的研究，在人的結(jié)直腸細(xì)胞中共鑒定了200個(gè)成熟的已知 miRNAs和133個(gè)新發(fā)現(xiàn)的候選 miRNAs。隨著miRNAs芯片及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得不同動(dòng)物腸道中越來(lái)越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。在鼠上，McKenna等[10]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在小鼠空腸組織黏膜層檢測(cè)到了1 094個(gè)成熟miRNAs序列，其中得到證實(shí)的miRNAs表達(dá)序列有545個(gè)，進(jìn)一步分析結(jié)果表明，這些miRNAs分屬540個(gè)miRNAs家族，并且涵蓋了574個(gè)已知前體miRNAs(pre-miRNAs)中的339個(gè)。通過(guò)進(jìn)一步比較小鼠空腸黏膜與肝、胰組織的miRNAs轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了65個(gè)在小腸黏膜特異性表達(dá)的miRNAs[11]。在 豬 上，Sharbati-Tehrani 等[12]首 先通過(guò)多聯(lián)體克隆的方法在31日齡仔豬空腸和回腸組織鑒定了11種miRNAs，并進(jìn)一步利用miR-Q方法驗(yàn)證了 miR-21、miR-24、miR-181a、miR-326、miR-423-3p、miR-484和miR-143在豬腸道組織中的表達(dá) 等 利用miRNA深度測(cè)序技術(shù)結(jié)合miRNAome芯片檢測(cè)方法，研究了31日齡仔豬整個(gè)腸道組織(十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸)的miRNAs表達(dá)圖譜，共發(fā)現(xiàn)332個(gè)miRNAs表達(dá)序列，其中201個(gè)miRNAs為在豬腸道中新發(fā)現(xiàn)的候選miRNAs。通過(guò)對(duì)miRNAs序列進(jìn)行信號(hào)通路分析表明，它們可能在仔豬腸道各相關(guān)功能方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，Coutinbo等[15]對(duì)30日齡胎牛小腸組織進(jìn)行了miRNAs測(cè)序，共檢測(cè)到了559個(gè)miRNAs序列，其中187個(gè)在小腸組織中呈特異性表達(dá)。

2 miRNAs對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響

腸道上皮細(xì)胞作為腸道上皮組織發(fā)揮消化、吸收、內(nèi)外分泌等的主要功能細(xì)胞及構(gòu)成免疫屏障的重要組成部分，其增殖、分化和凋亡的程度直接與腸道的健康密切相關(guān)，而miRNAs在一定程度上主宰了腸道上皮細(xì)胞的命運(yùn)。在Dicer1酶基因(該基因編碼了腸道上皮miRNAs生物合成的必需酶)缺失的小鼠體內(nèi)，其腸上皮組織結(jié)構(gòu)紊亂，空腸和結(jié)腸部位的杯狀細(xì)胞數(shù)量降低，隱窩細(xì)胞凋亡顯著增加，空腸段的細(xì)胞遷移率增加[10]。在斑馬魚(yú)胚胎上的研究發(fā)現(xiàn)，雖然miR-145在其腸道平滑肌中高度表達(dá)，但改變其表達(dá)的水平除了導(dǎo)致了斑馬魚(yú)腸道平滑肌功能的缺陷，還致使其上皮組織形態(tài)發(fā)育未成熟以及堿性磷酸酶表達(dá)缺失等腸道發(fā)育異常狀態(tài)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-145是通過(guò)其靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子 Gata家族中的gata6起作用的[16]。通過(guò)研究未分化細(xì)胞株Caco2-BBE和已分化細(xì)胞株HT29-Cl.19A的miRNAs表達(dá)差異，Dalmasso 等[17]認(rèn)為 miRNAs在決定腸道上皮細(xì)胞的特有生理功能方面起了一定作用。Hino等[18]研究表明，參與動(dòng)物腸道上皮組織細(xì)胞分化過(guò)程的miRNAs是通過(guò)具有種特異性的轉(zhuǎn)錄因子起作用的，且這些miRNAs能夠以組織特異性的方式調(diào)控其靶基因的表達(dá)。Liao等[19]通過(guò)分離、培養(yǎng)小鼠的隱窩細(xì)胞，并利用類胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖24 h后，采用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)到了多個(gè)miRNAs的差異表達(dá)，特別是miR-103的表達(dá)極顯著下調(diào)。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶和免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)miR-103是通過(guò)作用于其靶基因，包括細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶-2(CDK2)和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1(CREB1)等參與了細(xì)胞周期G1/S的部分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，miR-16也通過(guò)抑制細(xì)胞周期G1/S的某些特定調(diào)控因子的表達(dá)影響了腸道上皮細(xì)胞的增殖[20]。

3 miRNAs與腸道黏膜免疫及抗炎作用

miRNAs同樣也是腸道黏膜免疫的一類關(guān)鍵調(diào)控因子。在Dicer1酶滅活的小鼠結(jié)腸上皮組織的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且其特異性輔助性T細(xì)胞2(Th2)的影響因子抵抗素樣分子家族β(RELMβ)也大量降低，從而導(dǎo)致小鼠腸道黏膜免疫力缺失，抗寄生蟲(chóng)感染能力下降。進(jìn)一步研究表明，miRNAs通過(guò)調(diào)控杯狀細(xì)胞的分化和促進(jìn)Th2的抗寄生蟲(chóng)感染的免疫反應(yīng)在腸道免疫中發(fā)揮作用[21]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-375在腸道上皮-免疫系統(tǒng)作用的發(fā)揮中是必不可少的[22]。Dkhil等[23]研究了球蟲(chóng)感染對(duì)Balb/c小鼠腸道m(xù)iRNA表達(dá)圖譜的影響，結(jié)果表明，口服乳突艾美耳球蟲(chóng)(E.papillata)4 d后，在小鼠空腸的634個(gè)miRNAs中發(fā)現(xiàn) miR-1959、miR-21、miR-203和 miR-M23-1-5P 4個(gè)miRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究表明，大蒜提取物能夠使球蟲(chóng)感染的小鼠空腸組織中上述前3個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNAs表達(dá)豐度相應(yīng)回調(diào)，同時(shí) miR-142-5P、miR-15A、miR-10A、miR-29B、miR-1902、miR-125A-5P、let-7E、miR-148A、miR-130A、miR-10B和 miR-93等miRNAs表達(dá)上調(diào)[24]。利用 Caco2-BBE細(xì)胞株進(jìn)行研究證實(shí)，miR-92b、miR-7和miR-802均分別通過(guò)作用于其靶基因腸道肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PepT1)、CD98和血管緊張素Ⅱ-Ⅰ型受體(AT1R)的 3'非翻譯區(qū)域(UTR)，而最終在腸道抗炎作用中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[25-27]。

4 miRNAs在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用

腸道組織的特征之一是富有與生物體共生的龐大微生物區(qū)系，動(dòng)物一出生即有細(xì)菌定植，腸道上皮細(xì)胞可與高達(dá)1013的腸道菌群共生。然而，暴露于如此龐大的微生物群體，腸道上皮細(xì)胞是如何與其共生的呢?腸道穩(wěn)態(tài)又是如何被維持的呢?研究證實(shí)，miRNAs的表達(dá)對(duì)于維持腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。Chassin等[28]研究表明，在大量細(xì)菌定植后，腸道m(xù)iR-146a的上調(diào)表達(dá)避免了細(xì)菌或者細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)對(duì)腸道黏膜的損傷，miR-146a主要通過(guò)翻譯抑制和蛋白降解的方式作用于Toll樣受體(TLR)信號(hào)分子白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1)發(fā)揮了這種保護(hù)功能。但miR-146a的這種調(diào)控作用卻不是腸道保持穩(wěn)態(tài)唯一的機(jī)制，缺乏miR-146a表達(dá)的小鼠在出生后的前幾周仍然是健康的[29]。與無(wú)菌小鼠相比，微生物的定植分別使小鼠的回腸和結(jié)腸組織的1個(gè)(miR-298)和8個(gè)miRNAs(miR-128、miR-200c* 、miR-342-5p、miR-465c-5p、miR-466d-3p、miR-466d-5p、miR-665、miR-683)異 常 表達(dá)[25]。Singh 等[30]在無(wú)菌和正常雄性小鼠的盲腸組織中檢測(cè)到了334個(gè)miRNAs的表達(dá)，其中包括16個(gè)在無(wú)菌小鼠盲腸異常表達(dá)的miRNAs。上述研究證實(shí)，腸道內(nèi)源微生物區(qū)系顯著影響了腸道m(xù)iRNAs的表達(dá)特征，提示miRNAs在共生菌調(diào)控腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)過(guò)程中起到了一定作用。

此外，有研究證實(shí)，腸道m(xù)iRNAs還參與了腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及在抗應(yīng)激方面發(fā)揮了調(diào)控作用。Liao等[31]利用載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡等技術(shù)研究表明，miR-584顯著降低了Caco-2細(xì)胞和哺乳期小鼠小腸組織中的內(nèi)源性乳鐵蛋白受體蛋白的表達(dá)，提示miRNAs可能參與了新生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程的調(diào)控。Yu等[32]研究了熱應(yīng)激對(duì)大鼠小腸組織中miRNAs和mRNAs表達(dá)圖譜的影響。試驗(yàn)在對(duì)Sprague-Dawley雄性大鼠進(jìn)行每日2 h，連續(xù)10 d的熱應(yīng)激處理后，通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)束后3 d對(duì)小腸的空腸段損傷最嚴(yán)重。進(jìn)一步利用mRNAs芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激大鼠空腸組織中的270個(gè)基因上調(diào)和122個(gè)基因下調(diào);miRNAs芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了18個(gè)miRNAs上調(diào)和11個(gè)miRNAs下調(diào)。而且通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，異常表達(dá)的mRNAs和miRNAs之間呈負(fù)相關(guān)。

5 小結(jié)

在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，保障畜禽自身健康是進(jìn)行動(dòng)物生產(chǎn)的基本要素，而畜禽的健康狀況則主要取決于其胃腸道的健康，特別是幼畜的腸道發(fā)育和成熟被認(rèn)為是制約其快速生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)講，徹底闡明影響畜禽腸道發(fā)育和成熟的分子機(jī)制對(duì)于促進(jìn)畜禽生產(chǎn)具有極為重要的理論意義。而現(xiàn)有研究表明，miRNAs在動(dòng)物腸道的發(fā)育、成熟和健康等多個(gè)方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。因此，結(jié)合現(xiàn)有的各種研究手段和方法深入探討miRNAs在幼畜的腸道發(fā)育和成熟過(guò)程中的作用，以及在各種應(yīng)激或病原感染條件下，腸道組織中差異表達(dá)的特異性 miRNAs、miRNAs基因簇或miRNAs家族的協(xié)同作用及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或信號(hào)通路，有望成為畜禽健康養(yǎng)殖基礎(chǔ)研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。

[1]XU N，PAPAGIANNAKOPOULOS T，PAN G，et al.MicroRNA-145 regulates OCT4，SOX2，and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J].Cell，2009，137:647-658.

[2]LEUNG A K L，SHARP P A.MicroRNAs:a safeguard against turmoil?[J].Cell，2007，130:581-585.

[3]PIEPOLI A，TAVANO F，COPETTI M，et al.miRNA expression profiles identify drivers in colorectal and pancreatic cancers[J].PLoS One，2012，7:e33663.

[4]SARVER A L，F(xiàn)RENCH A J，BORRALHO P M，et al.Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states[J].BMC Cancer，2009，9:401.

[5]ZHANG B，WANG X K，WANG Y.Altered gene expression and miRNA expression associated with cancerous IEC-6 cell transformed by MNNG[J].Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2009，28:56.

[6]OLARU A V，SELARU F M，MORI Y，et al.Dynamic changes in the expression of microRNA-31 during inflammatory bowel disease-associated neoplastic transformation[J].Inflammatory Bowel Diseases，2011，17:221-231.

[7]ZHOU Q Q，SOUBA W W，CROCE C M，et al.MicroRNA-29a regulates intestinal membrane permeability in patients with irritable bowel syndrome[J].Gut，2010，59:775-784.

[8]BAZETT M，PAUN A，HASTON C K.MicroRNA profiling of cystic fibrosis intestinal disease in mice[J].Molecular Genetics and Metabolism，2011，103:38-43.

[9]CUMMINS J M，HE Y P，LEARY R J，et al.The colorectal microRNAome[J].Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of A-merica，2006，103:3687-3692.

[10]MCKENNA L B，SCHUG J，VOUREKAS A，et al.MicroRNAs control intestinal epithelial differentiation，architecture，and barrier function[J].Gastroenterology，2010，139:1654-1664.

[11]GAO Y，SCHUG J，MCKENNA L B，et al.Tissuespecific regulation of mouse microRNA genes in endoderm-derived tissues[J].Nucleic Acids Research，2011，39:454-463.

[12]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，SCHOLVEN J，et al.Concatameric cloning of porcine microRNA molecules after assembly PCR[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，375:484-489.

[13]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，BERGBAUER R，et al.miR-Q:a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample[J].BMC Molecular Biology，2008，9:34.

[14]SHARBATI S，F(xiàn)RIEDL?NDER M R，SHARBATI L，et al.Deciphering the porcine intestinal microRNA transcriptome[J].BMC Genomics，2010，11:275.

[15]COUTINBO L L，MATUKUMALLI L K，SONSTEGARD T S，et al.Discovery and profiling of bovine microRNAs from immune-related and embryonic tissues[J].Physiological Genomics，2007，29:35-43.

[16]ZENG L，CARTER A D，CHILDS S J.miR-145 directs intestinal maturation in zebrafish[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106:17793-17798.

[17]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.MicroRNAs determine human intestinal epithelial cell fate[J].Differentiation，2010，80:147-154.

[18]HINO K，TSUCHIYA K，F(xiàn)UKAO T，et al.Inducible expression of microRNA-194 is regulated by HNF-1α during intestinal epithelial cell differentiation[J].RNA，2008，14:1433-1442.

[19]LIAO Y L，L?NNERDAL B.Global microRNA characterization reveals that miR-103 is involved in IGF-1 stimulated mouse intestinal cell proliferation[J].PLoS One，2010，5:e12976.

[20]BALAKRISHNAN A，STEARNS A T，PARK P J，et al.MicroRNA miR-16 is anti-proliferative in enterocytes and exhibits diurnal rhythmicity in intestinal crypts[J].Experimental Cell Research，2010，316:3512-3521.

[21]GOTO Y，KIYONO H.Epithelial cell microRNAs in gut immunity[J].Nature Immunology，2011，12:195-197.

[22]BITON M，LEVIN A，SLYPER M，et al.Epithelial microRNAs regulate gut mucosal immunity via epithelium-T cell crosstalk[J].Nature Immunology，2011，12:239-246.

[23]DKHIL M，ABDEL-BAKI A A，DELI C'D，et al.Eimeria papillata:upregulation of specific miRNA-species in the mouse jejunum[J].Experimental Parasitoligy，2011，127:581-586.

[24]AL-QURAISHY S，DELIC D，SIES H，et al.Differential miRNA expression in the mouse jejunum during garlic treatment of Eimeria papillata infections[J].Parasitology Research，2011，109:387-394.

[25]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.Microbiota modulate host gene expression via microRNAs[J].PLoS One，2011，6:e19293.

[26]NGUYEN H T T，DALMASSO G，YAN Y T，et al.MicroRNA-7 modulates CD98 expression during intestinal epithelial cell differentiation[J].The Journal of Biological Chemistry，2010，285:1479-1489.

[27]SANSOM S E，NUOVO G J，MARTIN M M，et al.miR-802 regulates human angiotensinⅡtype 1 receptor expression in intestinal epithelial C2BBe1 cells[J].American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2010，299:G632-G642.

[28]CHASSIN C，KOCUR M，POTT J，et al.miR-146a mediates protective innate immune tolerance in the neonate intestine[J].Cell Host ＆ Microbe，2010，8:358-368.

[29]LU L F，BOLDIN M P，CHAUDHRY A，et al.Function of miR-146a in controlling treg cell-mediated regulation of Th1 responses[J].Cell，2010，142:914-929.

[30]SINGH N，SHIRDEL E A，WALDRON L，et al.The murine caecal microRNA signature depends on the presence of the endogenous microbiota[J].International Journal of Biological Sciences，2012，8:173-186.

[31]LIAO Y，L?NNERDAL B.miR-584 mediates posttranscriptional expression of lactoferrin receptor in Caco-2 cells and in mouse small intestine during the perinatal period[J].The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2010，42:1363-1369.

[32]YU J，LIU F L，YIN P，et al.Integrating miRNA and mRNA expression profiles in response to heat stress-induced injury in rat small intestine[J].Functional ＆ Integrative Genomics，2011，11:203-213.