張啟英，張?zhí)熘?，郭兆彬，朱長皓，顧寧

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇南京 210009)

體內(nèi)組織的生長過程是在一定內(nèi)環(huán)境條件下進(jìn)行的，傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)［1］并不能夠提供組織正常發(fā)育所需的環(huán)境條件，因而細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上會發(fā)生改變，進(jìn)而影響其分化、基因表達(dá)等。三維細(xì)胞培養(yǎng)作為一種新興的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性。這種技術(shù)能夠把體外二維培養(yǎng)與動物模型結(jié)合起來，形成一種方便高效的研究體系，并為研究腫瘤的形成及抗腫瘤藥物的篩選和組織工程等方面提供重要的平臺［2-3］。

近年來隨著生物材料領(lǐng)域的發(fā)展，用于體外三維細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料有很多。三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的主要形式有水凝膠［4］、纖維［5］和多孔結(jié)構(gòu)［6］3 種。多孔微球支架因其高表面積、高效細(xì)胞擴增性和可注射性引起廣泛關(guān)注。這種應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的微小球狀支架材料又稱為“微載體”(microcarrier)，通常由二氧化硅、玻璃、右旋糖苷或其它類似材料制備，用于生物催化劑的固定或是作為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的支持體［7］。采用微球的培養(yǎng)方法于1967年首先由Van Wezel［8］提出，當(dāng)時選用陰離子交換樹脂Sephadex A50培養(yǎng)動物細(xì)胞并獲得成功。與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，微球培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)細(xì)胞方面具有許多優(yōu)點，如能提供大的表面積、節(jié)省培養(yǎng)空間降低成本、能更好地模擬復(fù)雜的生理環(huán)境、便于懸浮培養(yǎng)和提高細(xì)胞的表型表達(dá)等［9-15］，因此是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，并且已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞的大量培養(yǎng)中［16-17］。國內(nèi)外在微載體的開發(fā)方面已做了許多工作，并有一些商品化的微載體在科研生產(chǎn)領(lǐng)域中得到應(yīng)用。因此，作者就對多孔微球的制備、修飾以及其對細(xì)胞培養(yǎng)的影響進(jìn)行綜述如下。

1 多孔微球的制備方法

表面及內(nèi)部具有多孔結(jié)構(gòu)的微球相對于實心或是微囊結(jié)構(gòu)比表面積增加，有利于細(xì)胞的大量黏附，開孔結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和代謝物質(zhì)的排出以及細(xì)胞間的相互作用。目前制備多孔微球的方法主要有乳化分散溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、相分離法［18］、熔融法等，其中最常用的是致孔劑聯(lián)合乳化分散溶劑揮發(fā)法。

1.1 致孔劑聯(lián)合乳化分散溶劑揮發(fā)法

致孔劑聯(lián)合乳化分散溶劑揮發(fā)法是制備多孔微球較簡單也是較常用的方法，致孔劑多采用NH3HCO3、蔗糖、NaHCO3、石蠟等。Kim等［19］用復(fù)乳有機溶劑揮發(fā)法將致孔劑 NH3HCO3加入到內(nèi)水相中，制備出PLGA多孔微球，微球內(nèi)部具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑與微球直徑隨著添加NH3HCO3濃度的增高而增大。10%NH3HCO3實驗組微球孔徑平均為20μm，NIH3T3細(xì)胞在微球表面黏附增殖良好，并在種植7 d后可觀察到細(xì)胞長入微球孔內(nèi)。Sahoo等［20］用蔗糖作為致孔劑，用復(fù)乳有機溶劑法通過調(diào)節(jié)控制內(nèi)水相和油相的比例及初乳和外水相的比例，制備出不同粒徑和孔徑的PLGA和PLA多孔微球，并考察了乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)在微球支架上的生長情況。結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞在PLA微球上的黏附增殖明顯好于PLGA微球，接種9 d后細(xì)胞數(shù)增長7倍，并包裹PLA微球形成腫瘤細(xì)胞團結(jié)構(gòu)。為構(gòu)建體外腫瘤模型，研究腫瘤發(fā)生機理及評價抗腫瘤藥物療效提供了可行性。Naidoo等［21］將NaHCO3加入到聚己內(nèi)酯(PCL)油相中制備單乳O/W乳液，通過有機溶劑的揮發(fā)制備出微孔球形支架。粒徑大小在50～200μm。球內(nèi)孔徑達(dá)到75 μm，表面孔徑為20 μm。Shi等［22］用 NaHCO3作致孔劑，采用復(fù)乳有機溶劑揮發(fā)法制備PDLLA多孔微球，通過改變初乳、復(fù)乳的攪拌速度以及聚合物在油相中的濃度及水解處理，制造出不同表面孔徑的多孔細(xì)胞微球，將人骨肉瘤細(xì)胞(MG-63)接種到微球表面，實驗結(jié)果顯示MG-63細(xì)胞在表面孔徑小于10μm的未經(jīng)過水解的微球上生長良好。說明不同種類的細(xì)胞適應(yīng)不同表面性質(zhì)的微球。

1.2 噴霧干燥法

噴霧干燥法主要是采用噴霧干燥器來實現(xiàn)，這種方法的優(yōu)點是操作簡便、條件溫和、可用于多孔微球的大規(guī)模制備。Straub等［23］采用雙腔的噴霧干燥器通過噴霧干燥一個包含PLGA、1，2-花生?；蚜字蚇H3HCO3的W/O乳液制備出多孔微球AI-700超聲造影劑。

1.3 相分離法

相分離法是在藥物與材料的混合溶液中加入另一種物質(zhì)或不良溶劑，或采用其他適當(dāng)手段使材料的溶解度降低，自溶液中產(chǎn)生一個新相(凝聚相)，這種制備微球的方法稱為相分離法。Nihant等［24］研究了相分離過程中攪拌速度、凝聚劑的滴加速度、兩相比例等因素對微球表面形態(tài)、孔的結(jié)構(gòu)等方面的影響。

1.4 熔融方法

熔融法不使用有機溶劑，對細(xì)胞無毒性作用，故所制備的支架可用于組織工程。Yodthong［25］用熔融方法制造出MPEG-b-PCLDLL多孔微球，此方法不添加表面活性劑和有機溶劑，只是通過將MPEG-b-PCLDLL雙嵌段聚合物水溶液加熱到80℃，磁力攪拌，研究結(jié)果顯示PDLL的添加比例與微球大小成反比。

2 影響多孔微球用于細(xì)胞培養(yǎng)的因素

多孔微球的尺寸、密度和孔大小等因素會影響細(xì)胞的培養(yǎng)和物質(zhì)的輸送。此外，微球的化學(xué)組成和表面性質(zhì)，如拓?fù)湫蚊病⒂H疏水性、表面電荷、表面官能團等許多因素也都會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生重要的影響。

2.1 多孔微球尺寸、密度、孔徑大小的影響

2.1.1 尺寸 多孔微球的尺寸影響著細(xì)胞的生長行為，細(xì)胞貼附數(shù)目取決于微球的尺寸(直徑在100～400μm之間更有利)。多孔微球的尺寸分布應(yīng)盡量窄，從而盡可能提供均勻的培養(yǎng)環(huán)境。有研究［26］表明，尺寸介于100～250μm的HA/TCP顆粒最有利于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長以及新骨的形成。

2.1.2 密度 多孔微球的密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基(一般在1.02～1.10之間)，經(jīng)輕度攪拌便能懸浮在培養(yǎng)基中，停止攪拌便能較快地沉降下來。有研究［27］表明對于采用細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的多孔微球，微球的密度對于細(xì)胞培養(yǎng)十分重要。這是因為當(dāng)微球密度高于培養(yǎng)基密度時，微球會向容器壁部遷移甚至產(chǎn)生碰撞。并且微球與培養(yǎng)基的密度相差越大，微球表面受到的剪切應(yīng)力越大。剪切應(yīng)力會影響細(xì)胞的生長、新陳代謝和聚集，因此剪切應(yīng)力的增大以及多孔微球之間和器壁之間的碰撞會破壞細(xì)胞的黏附和增殖。

2.1.3 孔徑大小 微球的孔徑大小也是影響細(xì)胞生長的一個重要因素。對于目前的多孔微球，孔徑大小只是一個統(tǒng)計學(xué)的數(shù)據(jù)。最基本的想法是，孔的尺寸應(yīng)該比細(xì)胞直徑大，以便細(xì)胞能夠進(jìn)入球的內(nèi)部，實現(xiàn)細(xì)胞在球內(nèi)的生長、擴增。對于大多數(shù)貼壁細(xì)胞，孔大于20μm(一般為40μm)是較為合適的。Messing和Oppermann通過實驗證明:對于微生物細(xì)胞，合適的微球孔直徑應(yīng)約為細(xì)胞直徑的1～5倍［28］。然而，對于動物細(xì)胞，這樣的數(shù)據(jù)是不具有可比性的，細(xì)胞類型、細(xì)胞多層生長能力和細(xì)胞侵入孔內(nèi)的能力都會對微球孔徑的選擇產(chǎn)生影響［29］。

2.2 多孔微球的化學(xué)組成和表面性質(zhì)的影響

2.2.1 親疏水性 多孔微球親疏水性對蛋白質(zhì)的構(gòu)象有重要影響，進(jìn)而會影響微球的細(xì)胞相容性。不同的細(xì)胞對材料的親疏水性要求不同，大部分研究表明適度親水性的表面最有利于細(xì)胞的黏附和鋪展［30］。這是因為微球的親水性強不利于蛋白質(zhì)的吸附，從而不利于細(xì)胞的黏附。而對于疏水性強的微球表面，一方面非黏附蛋白在微球表面的吸附會阻礙黏附蛋白的吸附;同時，吸附在表面的黏附蛋白分子鏈的天然構(gòu)象也會遭到破壞，使蛋白質(zhì)分子鏈中與細(xì)胞膜表面受體相結(jié)合的活性位點(RGD)無法完全暴露，也不利于細(xì)胞的黏附［31］。

2.2.2 表面電荷 在生理pH條件下，哺乳動物的細(xì)胞表面帶有分布不均勻的負(fù)電荷，一般認(rèn)為帶有正電荷的微球表面與帶負(fù)電荷的細(xì)胞之間的靜電吸引將有利于細(xì)胞的黏附。然而一些研究表明細(xì)胞在含有負(fù)電荷的表面也能夠很好地黏附［32］，這可能與表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)基中陽離子的媒介作用有關(guān)。Baldwin等［33］認(rèn)為表面電荷和離子化基團影響細(xì)胞黏附和生長的本質(zhì)在于黏附蛋白能被選擇性地吸附到帶電或離子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞與表面之間的黏附。

2.2.3 生物活性因子 一般當(dāng)多孔微球含有具有生物活性的成分時會有利于細(xì)胞的生長［34-36］。這是因為在細(xì)胞培養(yǎng)中，膠原等一些具有生物活性分子可以為細(xì)胞的黏附生長提供結(jié)合位點(氨基酸序列，如RGD肽段)。

將生物活性因子固定在材料表面是提高材料細(xì)胞相容性的有效手段之一［37］。常見的活性因子包括各種貼壁因子，如膠原、聚賴氨酸、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白(LN)和玻璃粘連蛋白;各種生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子、促進(jìn)骨和軟骨組織形成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等。

3 多孔微球的表面改性

由上述可知，多孔微球表面的性質(zhì)如親疏水性、表面電荷以及生物活性因子等都會對細(xì)胞在微球表面的黏附和生長能力產(chǎn)生影響。因此，通過對多孔微球表面進(jìn)行改性，可以促進(jìn)微載體的組織和細(xì)胞相容性。表面改性通常有化學(xué)修飾和生物分子修飾兩種方法。

3.1 化學(xué)修飾

化學(xué)修飾是通過化學(xué)反應(yīng)將活性化學(xué)基團引入到材料上，從而改善材料對細(xì)胞的親和性。由前述可知，微球表面的親疏水性、表面電荷都會對細(xì)胞的黏附和生長產(chǎn)生影響。因此，針對不同細(xì)胞，在微球表面引入氨基、羧基、羥基、磺酸基等基團有助于提高細(xì)胞在微球表面的黏附［38］。

3.2 生物分子修飾

目前，生物分子在微球表面的修飾引起廣泛關(guān)注。首先，生物分子本身具有生物相容性。其次，針對不同細(xì)胞可以選擇具有針對性的生物分子修飾在多孔微球表面，增強其特異性。常用生物分子及其修飾方法有以下幾種。

3.2.1 氨基酸及其衍生物修飾 將親水性的氨基酸引入多孔微球表面，不僅可以在改善材料的親水性同時還能夠引入羥基、氨基和羧基等基團。這些活性的側(cè)鏈可以進(jìn)一步與多肽、蛋白質(zhì)反應(yīng)，將其固定以改善多孔微球的細(xì)胞親和性。Nojehdehiana等［39］將表面修飾了多聚賴氨酸同時內(nèi)部裝載視黃酸(RA)的PLGA微球用于多功能胚胎腫瘤干細(xì)胞P19的培養(yǎng)，研究RA對于 P19分化成神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。這里，PLGA微球既作為一個藥物載體，又起到細(xì)胞支架的作用。帶有正電荷的聚賴氨酸可以改善PLGA微球的細(xì)胞黏附性。

3.2.2 膠原修飾 膠原是細(xì)胞外最重要的疏水性纖維蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架。膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中形成半晶體的纖維，給細(xì)胞提供抗張力和彈性，并在細(xì)胞的遷移和發(fā)育中起作用。膠原具有和細(xì)胞表面的整合素特異性結(jié)合的蛋白分子配體，因此，在多孔微球的表面修飾膠原可以有效地促進(jìn)細(xì)胞的黏附和分布。Hong等［34］采用O/W分散溶劑揮發(fā)法制備出尺寸在180～280μm的PLA微球，隨后在己二胺/正丙醇溶液中胺解，將氨基引入在微球表面，戊二醛處理后將氨基轉(zhuǎn)化為醛基，最后通過醛基和膠原分子氨基上的Schiff堿的形成將膠原共價偶聯(lián)到微球表面。膠原包覆的PLA微球用于體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果顯示，細(xì)胞可以在微球上黏附、增殖?？梢?，膠原修飾過的PLA微球可以作為潛在的體外細(xì)胞培養(yǎng)微載體。

3.2.3 LN修飾 LN作為基膜的主要結(jié)構(gòu)成分對基膜的組裝起關(guān)鍵作用，其主要功能就是在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞固定在基膜上。與此同時，LN還有許多其他的作用，如在細(xì)胞發(fā)育過程中刺激細(xì)胞粘著、細(xì)胞運動。Newman等［40］制備出表面修飾LN同時裝載RA的PLGA微球，研究胚胎癌細(xì)胞P19在微球表面的附著、生長、分化和RA的釋放調(diào)節(jié)P19細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。

3.2.4 RGD活性多肽序列修飾 RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)中，能夠與細(xì)胞表面的整合素特異性結(jié)合，有效地促進(jìn)細(xì)胞對生物材料的黏附［41］。RGD序列的空間結(jié)構(gòu)、修飾密度、周圍序列對其活性都有一定影響［42］。Chen等［43］制備出RGD修飾的聚乳酸(PLLA)微球，并用于軟骨細(xì)胞組織工程。RGD在提高微球細(xì)胞黏附性的同時還可以加強細(xì)胞與微球的相互作用。與空白無修飾PLLA微球經(jīng)過56 d的細(xì)胞生長對比實驗發(fā)現(xiàn)，RGD修飾過的微球可以有效地促進(jìn)細(xì)胞在微球上的黏附及細(xì)胞數(shù)量的增長。

4 結(jié) 語

多孔微球在三維細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究逐漸形成一個完整的體系，同時越來越多的應(yīng)用價值被發(fā)掘和應(yīng)用。其在制備技術(shù)、表面改性方法和抗腫瘤藥物篩選及組織工程應(yīng)用等方面都取得了一定的成就。目前，微載體的發(fā)展還面臨許多困難和難題，如多孔微球的取樣及分離、尋找合適的表面修飾分子以及輔助的培養(yǎng)方式，開發(fā)一些新的應(yīng)用等。同時，目前微球的機械性能對細(xì)胞生長分化的研究也被提上日程，引起關(guān)注。相信隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，這些問題會一一解決，微載體在腫瘤藥物篩選及腫瘤形成機制方面的應(yīng)用會取得巨大的成就，成為新興的研究熱點。

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