田 宇，黃 欣，趙 彤，朱玲玲，王剛石△

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓消化科，北京100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850）

胃癌是胃粘膜上皮細(xì)胞變異產(chǎn)生的惡性腫瘤，是我國最常見的惡性腫瘤之一。胃癌病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究資料表明胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，針對腫瘤相關(guān)基因的研究已成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用熒光標(biāo)記的mRNA差異顯示技術(shù)，通過比較人胃竇部腺癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜組織的基因表達(dá)，篩選出一條胃癌高表達(dá)基因序列，命名為胃癌相關(guān)基因213（gastric cancer related gene 213，GCRG213），該基因序列具有完整的開放讀碼框（open reading frame，ORF）［1］，在胃癌組織可以檢測到 GCRG213蛋白高表達(dá)，并且該基因可能具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用［2］。文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤的增殖特性與其在體內(nèi)的低氧環(huán)境密切相關(guān)，低氧環(huán)境是實(shí)體腫瘤的普遍特征，并具有通過改變基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤形成發(fā)展的潛能，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、血管生成調(diào)節(jié)蛋白、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白、代謝酶及轉(zhuǎn)錄因子等［3］，因此研究低氧環(huán)境下腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)變化具有重要意義。目前，在腫瘤細(xì)胞生存的低氧環(huán)境下，GCRG213基因的表達(dá)變化尚不明確。我們近期利用更新的 NCBI／GeneBank數(shù)據(jù)庫分析GCRG213序列，發(fā)現(xiàn)其為人長散在核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）家族成員，本研究利用細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱模擬低氧微環(huán)境，分別在20%O2及3%O2環(huán)境下培養(yǎng)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823，觀察低氧對細(xì)胞增殖及GCRG213表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胃粘膜細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞BGC-823由解放軍總醫(yī)院南樓消化科實(shí)驗(yàn)室保存。1640培養(yǎng)液、胎牛血清及胰蛋白酶均購自Hyclone公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜及β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；PVDF膜購自 Millipore公司；蛋白裂解液、Western blot超敏發(fā)光液購自北京普利萊公司；GCRG213單克隆抗體由解放軍總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室制備并保存；HRP-標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自MBL公司；Trizol購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自Takara公司。其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中，每2天換液一次，每5天傳代一次，細(xì)胞貼壁生長面積達(dá)培養(yǎng)瓶底部面積的80%且細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，進(jìn)行傳代分組。應(yīng)用低氧培養(yǎng)箱（Thermo 3111，Billups-Rothenberg，Del Mar，CA）模擬 3%O2濃度的低氧微環(huán)境。將正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823分別培養(yǎng)于20%O2和3%O2條件下24 h、48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖、RT-PCR和Western blot的檢測。

1.3 MTT檢測

收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，以3×103cells／well的密度接種到96孔板中，每孔加入200μl細(xì)胞懸液。每種細(xì)胞設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用無菌PBS填充，20%O2，5%CO2，37℃孵育10～12 h后，分別置于20%O2或3%O2培養(yǎng)24 h、48 h。然后每孔加入 20μl MTT溶液（5 mg／ml，即 0.5%MTT），37℃孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀A490 nm測量各孔吸光值。

1.4 RT-PCR檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板中，每孔加入2ml，在 20%O2，5%CO2，37℃孵育 10～12 h后，分別置于20%O2或3%O2培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度。取1μg總RNA，按試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，先于70℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min，再于 42℃1 h，70℃ 10 min，反應(yīng)后的cDNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，GCRG213基因引物序列如下：P1 5＇-AACTGCAGATGCAACAAGAA-3＇，P2 5＇-CGGGATCCAAGTTTTGAGTGAG-3＇，以人β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件如下：98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果以與內(nèi)參照的比值表示。

1.5 Western blot檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞混懸液，在 20%O2，5%CO2，37℃孵育 10～12 h后，分別置于20%O2或3%O2中繼續(xù)孵育48 h。分別從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出六孔板，用細(xì)胞刮輕刮六孔板底并收集細(xì)胞。RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，采用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE，上樣蛋白量為 30μg／well，恒壓電流，積層膠 60 V，分離膠 120 V電泳至凝膠底部。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，冰浴中以60 V恒壓電轉(zhuǎn)120min，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入用封閉液稀釋的一抗，4℃輕搖過夜。次日，取出一抗孵育的PVDF膜，TBST洗3次，每次洗10min；然后，按照1∶2 000比例加入封閉液稀釋的二抗，室溫輕搖2 h。HRP化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.6 序列同源性分析

將GCRG213序列提交到 NCBI／GeneBank，利用BLASTN和BLASTP與GeneBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用 Multalin在線（http：／／multalin.toulouse.inra.fr／）進(jìn)行 GCRG213序列和 LINE-1序列比對分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，各組間采用t檢驗(yàn)方法比較。

2 結(jié)果

2.1 低氧對胃癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞在3%O2環(huán)境中的存活率較20%O2環(huán)境下增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析具有顯著差異（P＜0.01，表 1）；進(jìn)一步分析，將 GES-1及 BGC-823細(xì)胞的24 h-20%O2組存活率標(biāo)準(zhǔn)化為1，分別比較每種細(xì)胞24 h-3%O2組、48 h-20%O2組、48 h-3%O2組相對存活率水平，發(fā)現(xiàn)在相同條件下GES-1細(xì)胞相對存活率比BGC-823細(xì)胞相對存活率高（圖1）。

Tab.1 Effectof hypoxia on GES-1 and BGC-823 cell proliferation（±s，n＝10）

Tab.1 Effectof hypoxia on GES-1 and BGC-823 cell proliferation（±s，n＝10）

**P＜0.01 vs GES-1 cell 20%O2； ＃＃P＜0.01 vs group BGC-823 cell20%O2

24 h 48 h GES-1 cell 20%O2 0.3065±0.0776 0.4733±0.1170 3%O2 0.3584±0.0896** 0.5806±0.0860**BGC-823 cell 20%O2 0.4507±0.0680 0.5790±0.0570 3%O2 0.4809±0.0530＃＃ 0.6721±0.0320 Group A490（nm）＃＃

Fig.1 Effectofhypoxia on GES-1 and BGC-823 cell relative vital rate

2.2 低氧對GCRG213表達(dá)的影響

結(jié)果表明，與在20%O2條件下相比，GES-1與BGC-823兩種細(xì)胞在3%O2條件下培養(yǎng)48 h后，GCRG213的mRNA及蛋白表達(dá)均有一定程度的升高（圖 2、圖 3）。

Fig.2 Detection of GCRG213mRNA expression by RT-PCR

Fig.3 Detection of GCRG213 protein expression byWestern blot

2.3 Blast分析結(jié)果

經(jīng)過序列同源分析比對，我們發(fā)現(xiàn)GCRG213核苷酸序列與LINE-1的第二個(gè)ORF（ORF2）序列93%同源，并且，GCRG213-ORF編碼的氨基酸序列與LINE-1 ORF2中核酸內(nèi)切酶（LINE-1 endonuclease，L1-EN）序列83%同源，結(jié)果見示意圖（圖4）。GCRG213在GeneBank上的登錄號為AY053451。

Fig.4 Relationship between GCRG213 and LINE-1.LINE-1 element，total length 6 049 bp，consists of the 5′-and3′-UTRs and two ORFs.LINI-1ORF2 containsendonuclease（EN）and reversetranscriptase（RVT）.The deduced amino acid sequence of GCRG213-ORF shared 83%homology with L1-EN sequence

3 討論

近年來低氧微環(huán)境與腫瘤的關(guān)系倍受關(guān)注，低氧可通過調(diào)控多種基因的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。為探討低氧對胃癌細(xì)胞BGC-823中GCRG213表達(dá)是否具有調(diào)控作用，我們應(yīng)用細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱對正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823進(jìn)行體外模擬低氧處理。MTT結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h及48 h后，與20%O2環(huán)境相比，3%O2培養(yǎng)的兩種細(xì)胞存活率均升高。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3%O2環(huán)境下GES-1的增殖率較BGC-823的增殖率高。有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，低氧可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期蛋白 D1表達(dá)減少，引起 G0／G1期阻滯［4］，低氧激活NF-κB引起細(xì)胞周期蛋白D1、D3表達(dá)下降，也可引起細(xì)胞周期停滯［5］，故低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞早期雖仍存活，但其分裂增殖已基本停止。正常胃粘膜細(xì)胞GES-1是通過SV40病毒轉(zhuǎn)化人胃上皮細(xì)胞得到的可在體外長期傳代的細(xì)胞系，具備永生化細(xì)胞的部分特性。鑒于低氧培養(yǎng)48 h后細(xì)胞增殖升高明顯，進(jìn)一步采用該條件處理后，應(yīng)用Western blot及RT-PCR方法檢測細(xì)胞中GCRG213蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果一致顯示，3%O2環(huán)境下GCRG213表達(dá)較20%O2環(huán)境培養(yǎng)組增高，表明3%低氧可使細(xì)胞中GCRG213基因表達(dá)增高。既往研究認(rèn)為，GCRG213在胃癌組織中高表達(dá)，且可能具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用，可見GCRG213在胃癌細(xì)胞低氧微環(huán)境下的增殖中可能發(fā)揮一定的作用。

基于以下理由，我們認(rèn)為GCRG213是有功能的L1-EN變異體：（1）GCRG213序列與 LINE-1 ORF2序列高度同源；（2）GCRG213-ORF編碼的氨基酸序列與L1-EN序列高度同源；（3）我們既往研究證實(shí)GCRG213可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖；（4）文獻(xiàn)報(bào)道很多組織能產(chǎn)生有功能的LINE-1 ORF2片段。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)低氧環(huán)境處理后，其GCRG213表達(dá)升高；近期有研究證實(shí)，低氧可以使LINE-1 ORF2中逆轉(zhuǎn)錄酶基因片段表達(dá)升高［6］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)。

人類基因組的97%由內(nèi)含子、移動元件、簡單重復(fù)序列等構(gòu)成，近五年來對這些序列及其功能的研究已成為熱點(diǎn)，LINE-1是其中的重要組成部分，占人類基因組的17%。LINE-1包含ORF1和ORF2兩個(gè)開放讀碼框，ORF2具有核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性（圖4）。LINE-1活動可以導(dǎo)致基因性疾病，并且與腫瘤和衰老都密切相關(guān)，在正常組織和細(xì)胞中處于沉默狀態(tài)［7，8］，但在多數(shù)的永生細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［9］，且活性較強(qiáng)，影響腫瘤細(xì)胞的生長。人體內(nèi)LINE-1通過基因序列及額外核苷酸片段的插入、外顯子的刪除、染色體倒位及5＇端轉(zhuǎn)導(dǎo)作用等方式，引起基因組不穩(wěn)定性［10］，進(jìn)而發(fā)生癌變。因此在胃癌中進(jìn)行的關(guān)于GCRG213的研究結(jié)果有助于我們深入認(rèn)識LINE-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制。關(guān)于低氧調(diào)控GCRG213表達(dá)以及GCRG213在細(xì)胞增殖中作用的分子機(jī)制目前尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究首次證實(shí)體外模擬低氧微環(huán)境可使胃癌細(xì)胞BGC-823和永生化正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中的LINE-1核酸內(nèi)切酶變異體GCRG213表達(dá)升高，為研究低氧對細(xì)胞中LINE-1片段表達(dá)的影響提供了有益的嘗試，也為胃癌發(fā)生發(fā)展的研究提供了新思路。

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