呂俊旭，蔣 淼

(1.山西省人民醫(yī)院消化科，山西太原 030012;2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化科)

Ghrelin是日本科學(xué)家Kojima發(fā)現(xiàn)的一種新的腦腸肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的生長(zhǎng)激素釋放激素受體(GHSR)的天然配體[1]。Ghrelin由28個(gè)氨基酸殘基組成，主要來源于胃粘膜X/A樣細(xì)胞，胃切除手術(shù)后血漿Ghrelin水平明顯下降[2-4]。Ghrelin作用的受體主要包括兩類:一是生長(zhǎng)激素促分泌受體1a(GHSR-1a），主要分布在下丘腦、腺垂體，有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)激素釋放作用;另一種是GHSR-1b，廣泛分布于胃腸道，但具體功能目前還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin不僅具有增加食欲、促進(jìn)胃動(dòng)力的作用，同時(shí)也是一種胃粘膜保護(hù)因子[5]。Sibilia的大鼠胃粘膜損傷實(shí)驗(yàn)顯示，外源性Ghrelin對(duì)胃粘膜具有保護(hù)作用[6]。胃粘膜保護(hù)是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，其中比較重要的就是環(huán)氧化物酶(COX）系統(tǒng)。COX是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素(PGs)的限速酶，對(duì)維持胃粘膜的完整性，增加胃粘膜的血流具有重要作用[7]。目前，Ghrelin對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用是否通過COXs起作用尚不清楚，因此，探討Ghrelin對(duì)胃粘膜COX-1、COX-2表達(dá)水平的影響，對(duì)研究Ghrelin在胃粘膜保護(hù)和炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康SD大鼠64只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司），體重400-500g，雌雄各半。Ghrelin(美國(guó)GenScript公司）按5μg/ml配制，PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，75%乙醇(上海利康消毒公司），PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司）。

1.2 大鼠急性胃粘膜損傷模型的建立和分組 大鼠隨機(jī)分為4組，每組16只大鼠(雌雄各半）:空白對(duì)照組，75%乙醇+生理鹽水對(duì)照組(生理鹽水組，NS組），75%乙醇+0.5μg Ghrelin干預(yù)組(0.5μg Ghrelin組，0.5μg GH組）和75%乙醇+5μg Ghrelin干預(yù)組(5μg Ghrelin組，5μg GH組）。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24h，自由飲水?？瞻讓?duì)照組大鼠僅腹腔注射生理鹽水;其余三組大鼠于腹腔注射生理鹽水或Ghrelin 1h后，予以75%乙醇(1ml/100g）灌胃，1h后麻醉大鼠取胃。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體標(biāo)本觀察:觀察各組大鼠胃大體標(biāo)本的變化。

1.3.2 評(píng)價(jià)胃粘膜損傷指數(shù):各組隨機(jī)選取8只大鼠，雌雄各半。取胃后10%甲醛固定30min，沿胃大彎剪開胃，展平置于解剖顯微鏡下(10×）觀察胃出血性病灶，使用測(cè)微尺測(cè)量胃粘膜損傷面積，并參照文獻(xiàn)計(jì)算胃粘膜損傷指數(shù)[8]。

1.3.3 組織學(xué)觀察:1.3.2中的8只大鼠胃竇部取材，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚5μm），HE染色，光鏡下觀察胃粘膜損傷程度及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

1.3.4 熒光半定量PCR法檢測(cè)大鼠胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表達(dá):取各組另外8只大鼠，麻醉后斷頭處死，取胃竇部液氮中保存。采用熒光半定量PCR法檢測(cè)胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表達(dá)。COX-1引物:上游5’-TTTGCACAACACTTCACCCACCAG-3’下游5’-AAACACCTCCTGGCCCACAGCCAT-3’，產(chǎn)物片段568bp;COX-2引物:上游5’-GTTGAAAGCCC TCTACCATGACA-3’，下游5’-TTGAGGCAGTGTTGA TGATCCT-3’，產(chǎn)物片段521bp;β-actin 引物:上游5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3’，下游5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATC TGC-3’，產(chǎn)物片段828bp(引物均由上海生工公司合成）。Trizol法提取胃竇部粘膜組織的總RNA;按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;以β-actin為內(nèi)參照行PCR 檢測(cè)，反應(yīng)條件為94℃ 60s、63℃ 45s、72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析后掃描，以COX-1和COX-2吸光度與β-actin吸光度的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，行方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察 生理鹽水組大鼠胃粘膜幾乎完全重度出血壞死，色澤發(fā)黑，粘膜脫落，組織松脆，觸之易出血;0.5μg GH組大鼠胃粘膜大部分有明顯糜爛出血，部分壞死，觸之易出血;5μg GH組大鼠胃粘膜見部分斑片狀糜爛出血，粘膜基本完整(圖1，見封二）。

2.2 胃粘膜損傷指數(shù) 兩個(gè)Ghrelin組大鼠的胃粘膜損傷指數(shù)明顯低于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01），并且呈劑量依賴性(見附表）。

附表 各組大鼠胃粘膜損傷指數(shù)和COX-1、COX-2 mRNA的表達(dá)(±s，n=8）

附表 各組大鼠胃粘膜損傷指數(shù)和COX-1、COX-2 mRNA的表達(dá)(±s，n=8）

與NS組比較:*P＜0.01，**P＜0.05;與5μg GH組比較:#P＜0.01

組別 胃粘膜損傷指數(shù) COX-1 mRNA COX-2 mRNA空白對(duì)照組 11±3.58* 0.57±0.04 0.26±0.02*NS 組 82±11.06 0.66±0.08 0.68±0.07 0.5μg GH 組 60±7.22*# 0.60±0.05 0.57±0.08**#5μg GH 組 41±6.10* 0.67±0.06 0.42±0.05*

2.3 HE染色結(jié)果 空白組大鼠胃粘膜結(jié)構(gòu)正常;NS組大鼠胃粘膜細(xì)胞排列紊亂，失去完整性及連續(xù)性，部分區(qū)域粘膜上皮層缺失，損傷累及胃深部腺體，可見大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。0.5μg GH組大鼠胃粘膜各層排列欠整齊，損傷累及胃小凹及胃腺體，也可見中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。5μg GH組大鼠胃粘膜結(jié)構(gòu)排列大部完整，部分胃腺體破壞，炎性細(xì)胞少見(圖2，見封二）。

2.4 胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表達(dá) 各組大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表達(dá)比較無(wú)明顯差異(P＞0.05）。兩個(gè)Ghrelin組大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表達(dá)明顯低于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05），并且呈劑量依賴性(見附表，圖3-4）。

圖3 各組大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表達(dá)

圖4 各組大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表達(dá)

3 討論

高濃度乙醇對(duì)胃粘膜的損傷機(jī)制是多方面的，包括脫水、蛋白凝固、溶解等作用，還可引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、刺激炎癥因子分泌等。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，各組大鼠胃粘膜損傷程度存在顯著差異，NS組大鼠胃粘膜嚴(yán)重壞死，為高濃度乙醇所致急性胃粘膜損傷的典型表現(xiàn)，0.5μg GH組大鼠胃粘膜損傷程度明顯輕于NS組，部分粘膜存在壞死，5μg GH組大鼠胃粘膜僅見斑片狀糜爛出血，粘膜基本完整;關(guān)于胃粘膜損傷指數(shù)的評(píng)估，0.5μg GH組和5μg GH組大鼠的胃粘膜損傷指數(shù)明顯低于NS組;組織學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)Ghrelin組大鼠的胃粘膜結(jié)構(gòu)排列較整齊，胃小凹和胃腺體損傷少，出血較NS組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也較NS組輕。表明外周予以Ghrelin能明顯減輕乙醇誘導(dǎo)的急性胃粘膜損傷，保護(hù)胃粘膜結(jié)構(gòu)的完整性，減少出血，具有較好的胃粘膜保護(hù)作用，同時(shí)可減少炎性反應(yīng)，并且這種保護(hù)作用呈量效關(guān)系。

前列腺素是保護(hù)和修復(fù)胃粘膜完整性的重要因子，也是重要的炎癥因子。環(huán)氧化酶是催化前列腺素的限速酶，有2個(gè)亞型:COX-1和COX-2。其中COX-1在大多組織中的表達(dá)比較穩(wěn)定，屬于“結(jié)構(gòu)酶”，可維持胃腸道、腎臟的血流穩(wěn)定，對(duì)胃粘膜起到保護(hù)和修復(fù)作用;COX-2在胃腸道一般為誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)物前列腺素及血栓素A2(TXA2)與炎癥反應(yīng)有關(guān)[9]。通過熒光半定量PCR法檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)，各組大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表達(dá)基本穩(wěn)定，無(wú)明顯差異，表明COX-1的表達(dá)不受乙醇和Ghrelin的影響。但各組大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表達(dá)存在顯著差異，NS組大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，表明乙醇可刺激胃粘膜COX-2的過度表達(dá)，通過產(chǎn)生大量前列腺素、TXA2導(dǎo)致胃粘膜水腫、炎性細(xì)胞聚集;兩個(gè)Ghrelin組大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表達(dá)均明顯低于NS組，并且降低程度呈量效關(guān)系，表明Ghrelin可抑制乙醇刺激的COX-2的高表達(dá)，通過減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)胃粘膜。

各種理化、藥物、應(yīng)激導(dǎo)致的急性胃粘膜出血是上消化道出血的常見原因，Ghrelin對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用可能會(huì)成為治療急性胃粘膜損傷的一種有效方法，值得進(jìn)一步深入探討。

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