楊菊，李小靜，張志湘，陸凱明，卞士中

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院病理科，上海 200240；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)系，江蘇蘇州 215123）

成年小鼠氯胺酮慢性中毒后腦細(xì)胞凋亡

楊菊1，李小靜1，張志湘2，陸凱明2，卞士中2

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院病理科，上海 200240；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)系，江蘇蘇州 215123）

目的研究不同持續(xù)時(shí)間和劑量下氯胺酮慢性中毒對(duì)成年小鼠腦細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響。方法氯胺酮按不同劑量（4、10、20、30mg/kg）每周2次于成年小鼠尾靜脈注射，建立小鼠氯胺酮濫用慢性中毒模型，氯胺酮連續(xù)注射1、2、4、8、12周后處死。采用透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞凋亡的定性檢測(cè)，以Caspase-3免疫熒光染色法和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）定量檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)，推斷凋亡發(fā)生的時(shí)間，并統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果氯胺酮染毒1周后，在透射電鏡下見到腦組織海馬及紋狀體區(qū)域有明顯的神經(jīng)元凋亡，并持續(xù)至8周后；染毒1周可見Caspase-3高表達(dá)，4周后呈持續(xù)低水平表達(dá)；染毒1周后可見TUNEL陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加，4周時(shí)仍處于高水平表達(dá)。結(jié)論氯胺酮尾靜脈注射可致成年小鼠神經(jīng)元凋亡。

法醫(yī)病理學(xué)；中毒；氯胺酮；物質(zhì)濫用，靜脈內(nèi)；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；小鼠

氯胺酮作為一種新型毒品，目前被廣泛濫用于各類休閑娛樂場(chǎng)所，并呈逐年增長的趨勢(shì)[1-2]。目前關(guān)于濫用氯胺酮的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，其慢性毒性作用的機(jī)制還不十分清楚。本研究采用成年小鼠尾靜脈注射給藥的方法，建立小鼠氯胺酮濫用慢性中毒模型，通過Caspase-3免疫熒光染色法和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）對(duì)小鼠腦細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，研究不同持續(xù)時(shí)間和劑量下氯胺酮慢性中毒小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)及可能的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），驢抗兔IgG（美國Sigma公司），TUNEL試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），氯胺酮注射液（國藥準(zhǔn)字H32022820，批號(hào)KH071004，2mL：0.1g，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明成年小鼠100只，雌雄不限，體質(zhì)量22～28g，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 中毒模型的建立及分組

取健康成年昆明小鼠，氯胺酮經(jīng)尾靜脈注射，每周2次，建立小鼠氯胺酮濫用慢性中毒模型。按隨機(jī)原則分為不同注射劑量（4、10、20、30mg/kg）的實(shí)驗(yàn)組以及1組對(duì)照組共5組，每組20只小鼠。各實(shí)驗(yàn)組在氯胺酮連續(xù)注射1、2、4、8和12周各取4只行斷頭處死。對(duì)照組在相同體積的生理鹽水注射后1、2、4、8 和12周行斷頭處死。觀察氯胺酮中毒小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。

1.3 方法

1.3.1 光鏡檢測(cè)

在小鼠斷頭處死后，取出腦組織并經(jīng)生理鹽水沖洗后投入10%中性甲醛溶液中固定24h，切取腦組織斷面包埋，行石蠟包埋切片（4 μm），常規(guī)脫蠟至水，HE染色。采用Olympus BX45顯微鏡觀察組織學(xué)形態(tài)。

1.3.2 透射電鏡檢測(cè)

在小鼠斷頭處死后，快速取海馬及紋狀體部約1mm×1mm×1mm大小的組織塊，投入4%戊二醛中及1%鋨酸雙重固定。丙酮逐級(jí)脫水，樹脂包埋。LKB-1型切片機(jī)（瑞典LKB公司）做超薄切片，厚度為50nm。枸櫞酸鉛染色。采用日立60型透射電鏡（日本日立高新技術(shù)公司）觀察氯胺酮注射后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的形成并進(jìn)行攝片。

1.3.3 Caspase-3免疫熒光染色檢測(cè)

已制作的腦組織石蠟包埋切片（4 μm），常規(guī)脫蠟至水。按試劑說明書進(jìn)行Caspase-3免疫熒光染色檢測(cè)，陽性物質(zhì)呈紅色熒光。

1.3.4 TUNEL檢測(cè)

同1.3.3組織制備。按TUNEL試劑盒說明書操作，進(jìn)行DNA原位末端標(biāo)記，陽性物質(zhì)呈綠色熒光。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將Caspase-3免疫熒光染色及TUNEL檢測(cè)結(jié)果用TCS SP2激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)各組分別取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)用x ±s表示，并應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮中毒小鼠行為學(xué)表現(xiàn)

對(duì)照組小鼠無明顯異常反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組小鼠在氯胺酮注射后0～15 s內(nèi)均呈現(xiàn)下述特征性的行為改變，持續(xù)時(shí)間10～300s。

隨注射劑量不同，4 mg/kg組注射后出現(xiàn)口角和面部抽動(dòng)，興奮性增加；10mg/kg組出現(xiàn)口角和面部抽動(dòng)及點(diǎn)頭，興奮性增加；20 mg/kg組出現(xiàn)口角和面部抽動(dòng)及點(diǎn)頭，前肢陣攣，有時(shí)出現(xiàn)后腿站立；30mg/kg組出現(xiàn)全身陣攣，跌倒，幾乎不能站立。

在隨時(shí)間改變的注射中，各實(shí)驗(yàn)組的行為強(qiáng)度減弱。4～20mg/kg組出現(xiàn)反應(yīng)的時(shí)間更晚，持續(xù)時(shí)間變短。30mg/kg組出現(xiàn)的時(shí)間及持續(xù)時(shí)間變化不明顯。

2.2 光鏡及透射電鏡檢測(cè)結(jié)果

光鏡下氯胺酮慢性中毒所致的一般組織病理學(xué)改變并不典型：腦組織結(jié)構(gòu)正常，見少量出血，未見明顯水腫，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，見胞核深染或無核改變。

透射電鏡下觀察見：對(duì)照組小鼠腦組織海馬及紋狀體組織正常。各實(shí)驗(yàn)組在首次注射1周后均可見處于不同時(shí)期的凋亡細(xì)胞。神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)呈空泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核固縮、邊緣化，細(xì)胞核裂解為碎片（圖1）。在4～20 mg/kg各組2～12周時(shí)，均可觀察到海馬及紋狀體神經(jīng)元凋亡。在30mg/kg組2～12周時(shí)，均未觀察到明顯的凋亡細(xì)胞。以上結(jié)果表明：小鼠氯胺酮中毒后可引起神經(jīng)元凋亡，而在大劑量組（30mg/kg）至實(shí)驗(yàn)后期時(shí)，未觀察到有細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步趨勢(shì)。

2.3 Caspase-3免疫熒光染色結(jié)果

對(duì)照組小鼠腦組織海馬及紋狀體神經(jīng)元Caspase-3的激活較少，而實(shí)驗(yàn)組在氯胺酮首次注射1周后神經(jīng)元Caspase-3激活增加（P＜0.05），主要表現(xiàn)在陽性細(xì)胞數(shù)的增加及熒光強(qiáng)度的增加。在8～12周，30mg/kg組中活化的Caspase-3的激活細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05）。而其他各實(shí)驗(yàn)組，與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性熒光物質(zhì)呈粗大顆粒狀，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。其后Caspase-3的激活呈時(shí)間依賴性減少，4周后呈持續(xù)性低水平表達(dá)（表1、圖2）。

2.4 TUNEL檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組小鼠腦組織神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞較少，而實(shí)驗(yàn)組在氯胺酮首次注射1周神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），主要表現(xiàn)在陽性細(xì)胞數(shù)的增加及熒光強(qiáng)度的增加，其后各組腦組織TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)呈時(shí)間依賴性減少，且陽性物質(zhì)熒光強(qiáng)度減弱，但4周時(shí)仍處于高水平表達(dá)（圖3、表2）。

在8～12周，30 mg/kg組中細(xì)胞凋亡數(shù)與對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05）。而其他實(shí)驗(yàn)組，與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，給予10mg/kg氯胺酮時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)最多，給予4～10mg/kg氯胺酮時(shí)，神經(jīng)元凋亡數(shù)有呈劑量依賴性增多趨勢(shì)，在20～30mg/kg組，量效關(guān)系不明顯（表2）。

圖1 氯胺酮中毒小鼠腦組織透射電鏡觀察結(jié)果×20000

表1 氯胺酮中毒小鼠神經(jīng)元Caspase-3激活細(xì)胞數(shù)（n=4，±s）

表1 氯胺酮中毒小鼠神經(jīng)元Caspase-3激活細(xì)胞數(shù)（n=4，±s）

注：1）與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，P＜0.05

組別1周2周4周8周12周對(duì)照13.8±5.912.8±4.512.2±5.014.8±5.716.0±5.6 4mg/kg85.8±6.31）79.8±6.81）70.8±7.31）63.8±7.61）52.8±8.71）10mg/kg90.8±6.11）86.4±7.61）78.4±7.21）67.4±6.41）58.6±7.21）20mg/kg77.2±7.91）72.8±6.51）67.2±6.21）62.2±5.91）54.8±7.41）30mg/kg74.5±4.81）69.8±6.81）62.8±6.81）27.6±7.723.0±7.6

圖2 氯胺酮中毒小鼠腦組織Caspase-3免疫熒光染色結(jié)果×400

圖3 氯胺酮中毒小鼠腦組織TUNEL熒光染色結(jié)果×400

表2 氯胺酮中毒小鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)（n=4，±s）

表2 氯胺酮中毒小鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)（n=4，±s）

注：1）與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，P＜0.05

組別1周2周4周8周12周對(duì)照7.4±3.68.8±3.38.2±3.59.4±3.511.6±4.4 4mg/kg59.2±6.81）45.6±8.11）40.6±6.61）35.2±5.81）31.2±5.71）10mg/kg64.8±6.61）60.4±7.01）52.4±4.81）39.6±5.31）34.2±5.61）20mg/kg57.4±7.91）55.4±8.31）49.4±6.61）44.8±6.31）41.8±6.21）30mg/kg52.8±8.91）49.6±6.91）45.4±7.61）22.6±10.121.0±8.6

3 討論

氯胺酮長期濫用者可造成記憶缺失、認(rèn)知功能損害和各種精神損害[3]。氯胺酮進(jìn)入血液循環(huán)后，大部分進(jìn)入腦組織。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，氯胺酮作用于幼年動(dòng)物后可引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[4-6]，持續(xù)使用NMDA受體拮抗劑氯胺酮導(dǎo)致持久性的認(rèn)知障礙[7]。

3.1 Caspase與細(xì)胞凋亡

近年來，細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究已取得了突破性進(jìn)展，人們提出了細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路：細(xì)胞凋亡的線粒體依賴途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活途徑。Caspase家族是重要的凋亡相關(guān)蛋白，參與線粒體依賴途徑與死亡受體途徑。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。活化的Caspase-3僅在凋亡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因而檢測(cè)Caspase-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細(xì)胞。

本研究中，觀察到小鼠氯胺酮中毒1周激活的Caspase-3表達(dá)即增加，高峰在氯胺酮注射后1周，其后逐漸減少，呈一定的時(shí)間依賴性。表明凋亡程序在首次注射后1周即已啟動(dòng)，在其后的過程中，仍有細(xì)胞不斷地進(jìn)入凋亡程序。至第12周時(shí)，在4～20mg/kg各實(shí)驗(yàn)組仍可見大量活化的Caspase-3表達(dá)。但在30mg/kg組，至第4周時(shí)，Caspase-3的激活已開始減少，至第8周時(shí)，檢測(cè)到Caspase-3的陽性物質(zhì)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明在30mg/kg組第4周時(shí)，進(jìn)入凋亡程序的細(xì)胞在減少，至8周時(shí)氯胺酮對(duì)細(xì)胞的凋亡作用已不明顯，不能誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)氯胺酮中毒小鼠活化的Caspase-3在10mg/kg劑量時(shí)表達(dá)最多，給予小鼠4～10mg/kg氯胺酮時(shí)，Caspase-3的激活細(xì)胞數(shù)與劑量有一定的相關(guān)性；20～30 mg/kg組劑量相關(guān)性不明顯。

3.2 氯胺酮濫用與腦細(xì)胞凋亡

海馬是腦邊緣系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)之一，是情感、行為、學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，在學(xué)習(xí)與記憶功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒和條件反射的形成。以上結(jié)果顯示，氯胺酮慢性中毒可誘導(dǎo)小鼠海馬及紋狀體部神經(jīng)元凋亡，與氯胺酮長期使用造成記憶缺失、認(rèn)知功能損害結(jié)論相一致[3，8]。

本研究中，透射電鏡檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了氯胺酮慢性中毒誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元凋亡。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氯胺酮慢性中毒誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元凋亡的趨勢(shì)與活化的Caspase-3的表達(dá)趨勢(shì)相一致，故有理由相信，小鼠氯胺酮慢性中毒時(shí)，神經(jīng)元發(fā)生凋亡是依賴Caspase-3的激活發(fā)生的。Caspase-3的激活增加說明了細(xì)胞凋亡的發(fā)生通過了Caspase-3激活途徑。最近研究[9]表明，氯胺酮可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體依賴途徑，但其具體的作用機(jī)制，是否有其他途徑參與其中，都有待于進(jìn)一步研究。

本研究中，氯胺酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在4～10mg/kg時(shí)與劑量有一定的相關(guān)性，但在20～30mg/kg時(shí)細(xì)胞凋亡與劑量的關(guān)系不明確。在30mg/kg組至第4周時(shí)凋亡顯著減少，至第8周時(shí)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[10]表明，存活的神經(jīng)元對(duì)細(xì)胞內(nèi)的最適“鈣調(diào)定點(diǎn)”有極強(qiáng)的依賴性，氯胺酮對(duì)鈣通道有劑量依賴性調(diào)節(jié)作用[11]。另有研究報(bào)道，大劑量的氯胺酮可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷，而在低劑量時(shí)沒有抑制[12]。是否大劑量的作用機(jī)理與小劑量不同，還有待進(jìn)一步的研究證明。

綜上所述，氯胺酮濫用慢性中毒可誘導(dǎo)成年小鼠腦細(xì)胞凋亡，并呈一定的劑量相關(guān)性，但在大劑量時(shí)，細(xì)胞凋亡與劑量的關(guān)系不明確。氯胺酮誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

[1]Mozayani A. Ketamine--Effects on human performance and behavior[J]. Forensic Science Review，2002，14（1）：123-131.

[2]Maxwell JC. The response to club drug use[J]. Current Opinion in Psychiatry，2003，16（3）：279-289.

[3]Morgan CJ，Riccelli M，Maitland CH，et al. Longterm effects of ketamine：evidence for a persisting impairment of source memory in recreational users[J]. Drug Alcohol Depend，2004，75（3）：301-308.

[4]Dong C，Rovnaghi CR，Anand KJ.Ketamine alters the neurogenesis of rat cortical neural stem progeni-tor cells[J]. Crit Care Med，2012，40（8）：2407-2416.

[5]Brambrink AM，Evers AS，Avidan MS，et al. Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain[J]. Anesthesiology，2012，116（2）：372-384.

[6]Liu F，Paule MG，Ali S，et al. Ketamine-induced neurotoxicity and changes in gene expression in the developing rat brain[J]. Curr Neuropharmacol，2011，9（1）：256-261.

[7]Curran HV，Morgan C.Cognitive，dissociative and psychotogenic effects of ketamine in recreational users on the night of drug use and 3 days later[J]. Addiction，2000，95（4）：575-590.

[8]Soriano SG，Liu Q，Li J，et al. Ketamine activates cell cycle signaling and apoptosis in the neonatal rat brain[J]. Anesthesiology，2010，112（5）：1155-1163.

[9]Bosnjak ZJ，Yan Y，Canfield S，et al. Ketamine induces toxicity in human neurons differentiated from embryonic stem cells via mitochondrial apoptosis pathway[J]. Curr Drug Saf，2012，7（2）：106-119.

[10]Johnson EM Jr，Deckwerth TL.Molecular mechanisms of developmental neuronal death[J]. Annu Rev Neurosci，1993，16：31-46.

[11]Sinner B，F(xiàn)riedrich O，Zink W，et al. The toxic effects of s（+）-ketamine on differentiating neurons in vitro as a consequence of suppressed neuronal Ca2+oscillations[J]. Anesth Analg，2011，113（5）：1161-1169.

[12]Yang J，Li W，Duan M，et al. Large dose ketamine inhibits lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J]. Inflamm Res，2005，54（3）：133-137.

（本文編輯：劉寧國）

Apoptosis in Adult Mouse Brain after Chronic Poisoning of Ketamine

YANG Ju1,LI Xiao-jing1,ZHANG Zhi-xiang2,LU Kai-ming2,BIAN Shi-zhong2
（1.Department of Pathology,the Fifth People’s Hospital of Shanghai,Fudan University,Shanghai 200240, China;2.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China）

ObjectiveTo study the effect of chronic poisoning of ketamine on brain cell apoptosis in adult mouse under different duration and doses.MethodsThe mouse model of chronic poisoning of ketamine was established on adult mouse by tail vein injection of ketamine twice every week with different doses （4,10,20 and 30mg/kg）.The mice were sacrificed after continuous injection of ketamine of 1,2,4,8 and 12 weeks.The qualitative assessment of apoptosis was made by transmission electron microscope and the quantitative assessment was made by Caspase-3 immumofluorescence staining method and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）to estimate the time point of apoptosis.All the experimental results were statistically analyzed.ResultsThe neuron apoptosis was observed in hippocampus and corpus striatum by transmission electron microscope one week after administration,and continued for eight weeks.High level of Caspase-3 expression was observed one week after administration,but with a low level expression after 4 weeks.The number of TUNEL positive cells obviously increased one week after administration and maintained in a high number at 4 weeks.ConclusionKetamine by tail vein injection could induce neuron apoptosis in adult mouse.

forensic pathology;poisoning;ketamine;substance abuse,intravenous;apoptosis;Caspase-3;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.002

1004-5619（2013）05-0325-05

楊菊（1982—），女，湖北荊州人，碩士，主要從事臨床病理學(xué)研究；E-mail：yangju_33@126.com

卞士中，男，主任法醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒理學(xué)研究；E-mail：bianshizhong@suda.edu.cn

2012-10-12）