魏 柏，熊枝繁，陳景三

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院1．腫瘤內(nèi)科;2．消化內(nèi)科，湖北武漢430077

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，它的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程。如何通過分子生物學(xué)手段達(dá)到改善胃癌療效已成為目前研究的主要方向。鐘基因是調(diào)節(jié)生物體周期性變化的物質(zhì)基礎(chǔ)［1-2］，近年來鐘基因和腫瘤的相關(guān)性逐漸引起學(xué)者們的重視。Bmal1作為生物鐘的重要調(diào)節(jié)因子之一，參與協(xié)調(diào)組織細(xì)胞的增殖、凋亡及生長代謝的節(jié)律性，在乳腺癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤中都有所表達(dá)，但在胃癌中的作用機(jī)制目前還不明確。本研究中我們采用免疫組化的方法檢測胃癌組織中Bmal1的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 組織標(biāo)本 15例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本取自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，取材后30 min內(nèi)投入液氮中速凍，后放入－80℃冰箱保存，用于Bmal1 mRNA表達(dá)檢測;另收集梨園醫(yī)院2005年－2008年病理科歸檔的原發(fā)性胃癌標(biāo)本64例及其配對(duì)癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上組織，經(jīng)病理檢查證實(shí)為非癌組織)蠟塊，男41例，女23例，年齡32～78歲，平均(51．3±5．4)歲。根據(jù)UICC分期:T1～T2期23例，T3～T4期41例;根據(jù)其分化程度分為:高－中分化48例，低分化16例。

1．2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司;兔抗人Bmal1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1．3 real time RT-PCR檢測 引物由上海生工合成，Bmal1(NM-001178)上游引物:5'-GTACCAACATGCAACGCAATG-3';下游引物:5'-TGTGTATGGATTGGTGGCACC-3';β-actin(NM-001101)上游引物:5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3';下游引物:5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。第一步提取上述組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;第二步做定量PCR，95℃10 min;接著95℃15 s;62℃60 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán);同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參，定量PCR的結(jié)果采用比較法測定目的基因的相對(duì)表達(dá)(即目的基因量=2△△Ct)，分析胃癌組織及癌旁組織Bmal1 mRNA的表達(dá)差異。

1．4 免疫組化染色和判斷標(biāo)準(zhǔn) 將標(biāo)本石蠟塊連續(xù)切片，貼于已處理過的載玻片上，置于烤片機(jī)上烘干以便進(jìn)行免疫組化染色。兔抗人Bmal1購自Santa Cruze公司，抗體稀釋比例為1∶50。

1．5 免疫組化結(jié)果判定 著色部位為胞漿和/或胞核，出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性細(xì)胞。免疫組化半定量分組的標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。染色程度:基本不著色為0級(jí)，淡黃色為1級(jí)，黃色為2級(jí)，棕褐色為3級(jí)。染色陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù):著色陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞＜5%為0級(jí)，5%～25%為1級(jí)，25%～50%為2級(jí)，50%～75%為3級(jí)，＞75%為4級(jí)，將染色程度分級(jí)與染色細(xì)胞百分比相乘，乘積＞4級(jí)為高表達(dá)，0～3為低表達(dá);同時(shí)采用同濟(jì)千屏影像公司HPIAS2000型圖像分析軟件，光學(xué)顯微鏡下每張片取6個(gè)高倍鏡下視野，輸入圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算陽性細(xì)胞的吸光度值以判斷蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間吸光度值的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Bmal1 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Bmal1 mRNA的擴(kuò)增曲線呈典型的S型，熔解曲線為單峰，排除非特異性的擴(kuò)增及引物二聚體的出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)15例胃癌及癌旁組織中Bmal1 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的檢測結(jié)果顯示，胃癌和癌旁組織中均有Bmal1 mRNA轉(zhuǎn)錄，胃癌組織中Bmal1 mRNA轉(zhuǎn)錄量為1．02±0．05，癌旁組織中為0．57±0．03，Bmal1 mRNA在胃癌中的轉(zhuǎn)錄量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

2．2 Bmal1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果及圖像分析軟件顯示，胃癌及癌旁組織中Bmal1均有表達(dá)，但Bmal1蛋白表達(dá)部位及表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。64例胃癌組織在細(xì)胞胞漿中可見Bmal1高表達(dá)，部分細(xì)胞胞核也可見Bmal1表達(dá)，細(xì)胞DAB染色棕色顆粒多，顏色深(見圖1～3);而相配對(duì)的癌旁組織中，棕色顆粒多聚集在細(xì)胞核且染色淺，為Bmal1低表達(dá)(見圖4)。

圖1 Bmal1在低分化胃癌中的表達(dá);圖2 Bmal1在中－低分化胃癌中的表達(dá);圖3 Bmal1在高分化胃癌組織中的表達(dá);圖4 Bmal1在癌旁組織中的表達(dá)(HE染色200×)Fig 1 Imm unohistochem ical stain of the Bmal1 p rotein in poorly differentiated gastric cancer;Fig 2 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in moderately-poorly differentiated gastric cancer;Fig 3 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in well-differentiated gastric cancer;Fig 4 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in adjacent tissue of gastric cancer (Orininal magnification 200×)

2．3 Bmal1的蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

Bmal1表達(dá)的平均吸光度值與胃癌患者性別、腫瘤大小、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無關(guān)，與年齡、分化程度呈正相關(guān)(見表1)。

2．4 Bmal1 mRNA和Bmal1蛋白表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織中Bmal1 mRNA轉(zhuǎn)錄量為1．02+0．05和Bmal1蛋白吸光度值為0．1816±0．0128，均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，mRNA與蛋白水平表達(dá)一致。

3 討論

本研究利用敏感性強(qiáng)、特異性高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，Bmal1 mRNA在胃癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，且胃癌組織中的轉(zhuǎn)錄量高于癌旁組織，可見Bmal1 mRNA的過表達(dá)可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。但本研究用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR病例數(shù)較少，影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需要更多病例樣本分析Bmal1 mRNA表達(dá)水平和腫瘤臨床病理特征各參數(shù)如腫瘤的大小、分級(jí)、轉(zhuǎn)移等的相關(guān)性。

表1 Bmal1的蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(±s)Tab1 The relationship between the expression of Bmal1 protein and clinicopathologic characteristics of gastric cancer

表1 Bmal1的蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(±s)Tab1 The relationship between the expression of Bmal1 protein and clinicopathologic characteristics of gastric cancer

臨床病理特征 例數(shù) Bmal1平均吸光度值P 22 0．2295±0．0210 64 0．1816±0．0128 0．03癌旁組織 64 0．1041±0．0543性別0．793男41 0．1668±0．0208女23 0．1454±0．0334年齡(歲) 0．04≥60 35 0．2216±0．0128＜60 29 0．1541±0．0543腫瘤大小(cm) 0．122≥3．5 22 0．1530±0．0300＜3．5 42 0．1662±0．0424分化程度0．001高－中分化 44 0．1488±0．0485低分化 20 0．2626±0．0125浸潤深度0．06 T1～T2 23 0．1579±0．0500 T3～T4 41 0．2125±0．0109淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0．06陰性 42 0．1692±0．0386陽性癌組織

既往研究已證實(shí)Bmal1在某些實(shí)體瘤中確有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)則通過免疫組化方法證實(shí)Bmal1蛋白在胃這一外周器官中確實(shí)有表達(dá)，可見作為生物鐘體系的起始因子使胃組織和細(xì)胞水平的生命活動(dòng)高度有序［3-4］，這與此前研究發(fā)現(xiàn)Bmal1以Clock-Bmal1異二聚體的形式選擇性與E-box結(jié)合，從而激活鐘基因體系中其他基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)論是一致的，由此推測胃作為一外周效應(yīng)器官，其生物節(jié)律除受到中樞生物鐘控制下的各種神經(jīng)、體液及其他信號(hào)分子直接或間接地調(diào)控外，自身也有一定生物節(jié)律性;免疫組化結(jié)果還提示在胃癌癌旁組織中Bmal1主要表達(dá)在胞核且表達(dá)弱，在胃癌組織的胞漿中有強(qiáng)表達(dá)，推測可能與Bmal1在胃癌細(xì)胞胞漿中無法正常泛素化降解，在胞漿中持續(xù)積聚，最終導(dǎo)致胞漿內(nèi) Bmal1高表達(dá)［5-6］有關(guān)，同時(shí)Per2蛋白的降低可促進(jìn)Bmal1的表達(dá)，Per與Cry蛋白復(fù)合體又促使Bmal1蛋白從異二聚體中解聚從而更易被降解［7］;也就是說Bmal1表達(dá)部位差異與胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中Clock/Bmal1環(huán)路異常激活導(dǎo)致鐘基因表達(dá)紊亂相關(guān)。

此外本研究結(jié)合免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)對(duì)Bmal1陽性細(xì)胞進(jìn)行平均吸光度值測試，結(jié)果表明Bmal1在胃癌組織的平均吸光度值高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見在胃癌組織中表現(xiàn)出的生物鐘基因與癌旁組織缺乏同步性，提示多方面因素如進(jìn)食、激素、細(xì)胞因子等可誘導(dǎo)生物節(jié)律鐘基因重置并顯示出一定的獨(dú)立性，推測Bmal1可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有一定程度的相關(guān)性，這與此前學(xué)者的報(bào)道相符［8］。本研究還證實(shí)Bmal1與患者性別、腫瘤大小、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無關(guān)，與年齡、分化程度呈正相關(guān)，推測與Bmal1參與細(xì)胞分化增殖、凋亡及生長過程相關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究分析提示Bmal1 mRNA和蛋白兩個(gè)水平在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，從而在mRNA和蛋白水平同時(shí)證明了Bmal1可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，其高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡的周期變化。考慮到腫瘤生物學(xué)行為很復(fù)雜，并且生物節(jié)律調(diào)控機(jī)制具有多樣性，因此單用Bmal1表達(dá)難以完全解釋，另一方面考慮樣本量也可對(duì)此造成影響，同時(shí)本研究屬于回顧性研究，標(biāo)本的變異和患者的選擇偏倚都可能造成假陰性的結(jié)果。因此，Bmal1作為生物節(jié)律基因是否可作為預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)目前尚無明確結(jié)論。

綜上所述，Bmal1的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，Bmal1有望成為胃癌診斷和預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)。在進(jìn)一步試驗(yàn)中我們將探索胃癌中生物鐘基因及蛋白產(chǎn)物如何改變及相互影響最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

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