房立杰，崔洪光，趙春暉，楊君微，王志偉，趙龍鉉,,*

（1. 遼寧師范大學 化學化工學院，遼寧 大連 116029；2. 大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；3. 遼寧師范大學 生物技術與分子藥物研發(fā)遼寧省重點實驗室，遼寧 大連 116029）

熊果酸和齊墩果酸D-苯甘氨酸綴合物的合成、表征及抗癌活性研究

房立杰1，崔洪光2，趙春暉3，楊君微1，王志偉1，趙龍鉉1,3,*

（1. 遼寧師范大學 化學化工學院，遼寧 大連 116029；2. 大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；3. 遼寧師范大學 生物技術與分子藥物研發(fā)遼寧省重點實驗室，遼寧 大連 116029）

熊果酸和齊墩果酸為同分異構體，同屬五環(huán)三萜類化合物，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗HIV、抗炎、降糖、保肝、抗瘧等生物活性。本文以具有一定生物活性的熊果酸和齊墩果酸為先導化合物，通過對它們C-28位甲酯化及C-3位導入D-苯甘氨酸，共設計合成了4種未見報道的熊果酸、齊墩果酸衍生物，利用IR和1H NMR波譜技術對其結構進行了表征。然后對目標產物進行了人神經膠質瘤U87ΔGEFR細胞和人肺癌細胞PC9/G體外抗癌活性測試。結果表明U-3對兩種癌細胞的抑制作用明顯優(yōu)于熊果酸和齊墩果酸。

熊果酸；齊墩果酸；D-苯甘氨酸；抗癌活性；合成

0 引言

D-苯甘氨酸(D-Phenylglycine)及其衍生物是制備β-內酰胺類抗生素的重要中間體，常用于氨芐青霉素、頭胞立新、頭胞克羅以及頭孢拉定等藥品的制備，同時，它還是合成多肽激素、多種農藥的重要中間體。由于它用途廣泛，合成后的醫(yī)藥產品既可注射又可口服，所以在醫(yī)藥市場前景廣闊[1]。熊果酸(Ursolic acid，簡稱UA)，又名烏蘇酸，屬于α-香樹酯醇型五環(huán)三萜類化合物。主要存在于木犀科植物連翹、薔薇科植物石楠葉等中。齊墩果酸(Oleanolic acid，簡稱 OA)，又名慶四素，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，在白花蛇舌草、女貞果實等植物中以游離形式存在或與糖結合成苷存在。五環(huán)三萜類化合物在自然界儲量豐富，并由于其特殊的細胞毒性且本身毒性較低的原因，長期以來都受到科學家們的青睞。熊果酸和齊墩果酸具有多種藥理活性，如抗腫瘤[2-3]、抗HIV[4]、抗炎[5]、降糖[6-7]、抗菌[8-9]、保肝[10-11]等多種生物活性。

雖然UA和OA藥用開發(fā)前景廣闊，但是對它們氨基酸綴合物的研究報道較少。為了研究和氨基酸綴合后的活性變化，我們分別以UA、OA為起始物，根據活性結構拼接原理，在其C-28位進行甲酯化，而后在C-3位引入苯甘氨酸，設計合成了UA和OA的苯甘氨酸綴合物。然后對目標產物進行了培養(yǎng)于DMEM的人神經膠質瘤U87GEFR△ 細胞和培養(yǎng)于RPMI-1640的人肺癌細胞PC9/G體外抗癌活性測試。合成路線如圖1和圖2所示。

圖1 熊果酸苯甘氨酸綴合物的合成路線

圖2 齊墩果酸苯甘氨酸綴合物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

WGH-30雙光束紅外分光光度計，KBr壓片；BRUKER-500MHz核磁共振儀，CDCl3為溶劑；X-5顯微熔點測定儀(控溫型)，溫度未經校正。所用的試劑均為國產分析純或化學純。

細胞株：人神經膠質瘤U87ΔGEFR細胞和人肺癌細胞PC9/G。

1.2 熊果酸甲酯(U-1)的合成和表征

在250 mL圓底燒瓶中加入UA(5 g，11 mmol)和無水K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)，再加入干燥的DMF(50 mL)，攪拌下慢慢滴加CH3I(1.37 mL，21.89 mmol)，常溫下攪拌 6 h，反應完畢后用水稀釋，用1N的鹽酸洗滌至微酸性，再用水洗至中性，并用飽和氯化鈉洗滌，所得有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗產品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:5, V:V)作洗脫劑進行加壓柱層析，分離得白色固體U-1: 熊果酸甲酯。產量：4.9 g，產率：95.0%，熔點：170.0～172.5 ℃;IR(KBr): 3452, 2923, 1722, 1458 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 5.25(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 3.60(s, 3H, -OCH3), 3.20(dd, J=10.4 Hz, 5.2 Hz, 1H, H-3), 2.22(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.06, 1.00, 0.93, 0.92, 0.85, 0.78, 0.73(s, each 3H).

1.3 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨?；芄峒柞?U-2)的合成和表征

在 100 mL圓底燒瓶中，將 U-1(400 mg，0.86 mmol)、Fmoc-D-phg-OH(382 mg，1.02 mmol)、DMAP (124 mg，1.02 mmol)溶于CH2Cl2(7 mL)中，將反應液冷卻到0 ℃，再將EDCI(197 mg，1.02 mmol)溶于CH2Cl2(3mL)中，在攪拌下逐滴加入反應瓶中，滴加完畢后在0 ℃條件下攪拌5 min，然后在室溫下攪拌5 h，反應完畢后，用CH2Cl2提取，并用飽和NaCl溶液洗滌，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗產品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:10, V:V)作洗脫劑進行加壓柱層析，分離得白色固體U-2: 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨?；芄峒柞ァ．a量：620 mg，產率：70.1%，熔點：114.6-116.5 ℃; IR(KBr): 3348, 2931, 1722, 1564, 1452 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.76(d, J=7.5 Hz, 2H, Fluorenyl H-4 & H-5), 7.58(d, J=6.2 Hz, 2H, Fluorenyl H-1 & H-8), 7.41-7.30 (m, 9H, Fluorenyl H-2 & H-3 & H-6 & H-7, 5×Ph-H), 5.99(d, J=6.8 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.32(d, J=7.1 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.57-4.48 (m, 1H, H-3), 4.39-4.38(m, 2H, -CHCH2OCONH-), 4.22-4.20(m, 1H, Fluorenyl H-9), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.22(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.4 3-O-苯甘氨?；芄峒柞?U-3)的合成和表征

在 100 mL圓底燒瓶中，將 U-2(200 mg，0.24 mmol)溶于CH2Cl2(5 mL)中，再加入二乙胺(5 mL)，常溫下攪拌2 h，反應完畢后，減壓蒸餾除去溶劑得粗產品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:2, V:V)作洗脫劑進行加壓柱層析，分離得白色固體U-3: 3-O-苯甘氨?；芄峒柞?。產量：128 mg，產率：88.3%，熔點：48.2～54.7 ℃; IR(KBr): 3447, 2937, 1731, 1581, 1436 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.40-7.25(m, 5H, 5×Ph-H), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.60(d, J=13.5 Hz, 1H, H2NCHOCO), 4.45-4.52(m, 1H, H-3), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.24(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.5 齊墩果酸甲酯(O-1)的合成和表征

按照合成U-1的實驗方法由化合物OA(5 g，11 mmol)反應得到白色固體O-1: 齊墩果酸甲酯。產量：5 g，產率：97.0%，熔點：197.0～198.0 ℃;IR(KBr): 3348, 2948, 1728, 1426 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 5.27(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 3.61(s, 3H, -OCH3), 3.20 (dd, J=10.4 Hz, 5.2Hz, 1H, H-3), 2.85(dd, J=14.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, H-18), 1.06, 1.00, 0.92, 0.78, 0.73(s, each 3H).

1.6 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基齊墩果酸甲酯(O-2)的合成和表征

按照合成U-2的實驗方法由化合物O-1(500 mg，1.07 mmol)、Fmoc-D-phg-OH(595 mg，1.59 mmol)反應得到了白色固體 O-2: 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基齊墩果酸甲酯。產量：520 mg，產率：73.7%，熔點：115.4～118.7 ℃; IR(KBr): 3340, 2922, 1730, 1577, 1472 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.76(d, J=7.5 Hz, 2H, Fluorenyl H-4 & H-5), 7.58(d, J=6.2 Hz, 2H, Fluorenyl H-1 & H-8), 7.41-7.30(m, 9H, Fluorenyl H-2 & H-7 & H-6 & H-3, 5×Ph-H), 5.99(d, J=6.8 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.32(d, J=7.1 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.57-4.48(m, 1H, H-3), 4.39-4.37(m, 2H, -CHCH2OCONH-), 4.21-4.19(m, 1H, Fluorenyl H-9), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.85(dd, J=14.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.7 3-O-苯甘氨?；R墩果酸甲酯(O-3)的合成和表征

按照合成U-3的實驗方法由化合物O-2 (200 mg，0.24 mmol)反應得到白色固體 O-3: 3-O-苯甘氨酰基齊墩果酸甲酯。產量：105 mg，產率：71.6%，熔點：194.6～196.8 ℃；IR(KBr): 3444, 2935, 1729, 1530, 1460cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.39-7.27(m, 5H, 5×Ph-H), 5.25(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 4.60(d, J=13.9 Hz, 1H, NH2CHOCO), 4.52-4.45(m, 1H, H-3), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.85(dd, J=13.9 Hz, 4.0 Hz, 1H, 4.2 Hz, H-18), 1.12, 0.98, 0.89, 0.87, 0.70, 0.63, 0.44(s, each 3H);

2 熊果酸、齊墩果酸苯甘氨酸綴合物的抗癌活性測試

2.1 細胞培養(yǎng)

將人神經膠質瘤U87 GEFR△ 細胞和人肺癌細胞PC9/G分別培養(yǎng)于DMEM和RPMI-1640，培養(yǎng)基內含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素。細胞培養(yǎng)的條件：控制溫度為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內。

2.2 抗腫瘤實驗

水溶性四唑鹽WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞數(shù)量呈正比。各類藥物由適量DMSO溶解，并由細胞培養(yǎng)液稀釋成實驗所需梯度濃度。

取對數(shù)生長期的細胞制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，按每孔100 μL將細胞懸液鋪于96孔板，設定無藥對照孔和空白對照孔，培養(yǎng)24 h后，吸去孔中培養(yǎng)液，各孔分別加入配制好的相應濃度的藥物100 μL。繼續(xù)孵育48 h，吸去孔中培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液。將96孔板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間，用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。實驗設藥物處理組、陰性對照組(不加藥物的細胞懸液)和空白對照組(只加培養(yǎng)液)。每組實驗結束后，計算細胞存活率，并根據細胞存活率繪制耐藥曲線，得到致半數(shù)細胞死亡的藥物濃度(半數(shù)致死濃度，IC50)值。

細胞存活率=(加藥孔A值-空白對照孔A值)／(細胞對照空A值-空白對照孔A值)×100%。

2.3 實驗結果

我們通過對所合成的目標化合物進行抗癌活性測試，計算細胞存活率，并根據細胞存活率繪制耐藥曲線，得到致半數(shù)細胞死亡的藥物濃度(半數(shù)致死濃度，IC50)值。所合成的目標化合物對 U87ΔGEFR、PC9/G細胞半數(shù)抑制濃度對照結果如表1所示。

表1 化合物對U87ΔGEFR、PC9/G細胞半數(shù)抑制濃度對照

3 結果與討論

我們做了以下工作：(1)首先以熊果酸和齊墩果酸為起始原料，分別在熊果酸和齊墩果酸C-28位引入甲基，在DMF溶劑中，無水K2CO3作用下與CH3I反應分別得到熊果酸甲酯和齊墩果酸甲酯。（2）在CH2Cl2溶劑中，DMAP和 EDCI作用下與Fmoc-D-phg-OH反應分別得到 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨?；芄峒柞ズ?3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨?；R墩果酸甲酯。（3）在CH2Cl2溶劑中，二乙胺作用下分別得到 3-O-苯甘氨?；芄峒柞ズ?-O-苯甘氨酰基齊墩果酸甲酯。

抗癌實驗結果顯示，先導化合物UA和OA對神經膠質瘤U87 GEFR△ 細胞和人肺癌細胞PC9/G均有一定的抑制作用，綴合物 O-2、O-3、U-2對兩種癌細胞的抑制作用不明顯，綴合物U-3對兩種癌細胞的抑制作用明顯優(yōu)于熊果酸。

4 結論

本文以熊果酸和齊墩果酸為起始物，通過對其C-28位甲酯化及C-3位引入苯甘氨酸，合成了4種未見文獻報道的熊果酸和齊墩果酸苯甘氨酸綴合物，采用IR、1H NMR對其進行了結構表征。并且，本文對所合成的熊果酸和齊墩果酸苯甘氨酸綴合物進行了體外抗癌活性研究，抗癌實驗結果表明先導化合物UA和OA對神經膠質瘤U87 GEFR△ 細胞和人肺癌細胞PC9/G均有一定的抑制作用，綴合物U-3對兩種癌細胞的抑制作用明顯優(yōu)于熊果酸和齊墩果酸。

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Synthesis and Characterization of D-phenylglycine Conjugates of Ursolic Acid and Oleanolic Acid, and the Study on the Anticancer Activity

FANG Li-jie1, CUI Hong-guang2, ZHAO Chun-hui3, YANG Jun-wei1, WANG Zhi-wei1, ZHAO Long-xuan1,3,*
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China; 3. Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China）

Ursolic acid and oleanolic acid are isomers and they both belong to the compound of pentacyclic triterpenoids. They show many biological activities, such as anti-tumor, anti-HIV, anti-inflammatory, hypoglycemic, hepatoprotective, antimalarial and many other kinds of pharmacological effects. We take the natural product ursolic acid and oleanolic acid which with biological activity as the lead compounds for modifying their structures in this paper, four novel ursolic acid and oleanolic acid derivatives were designed and synthesized through methyl esterification at C-28 of ursolic acid and oleanolic acid , and introducing D-phenylglycine at C-3. Structures of all target compounds were confirmed by IR and 1H NMR. These compounds were tested anticancer activity, which were human glioma cell U87△GEFR and human lung cancer cells PC9/G. The results showed that U-3 displayed higher inhibitory activity than ursolic acid and oleanolic acid for these two kinds of cancer cells.

ursolic acid; oleanolic acid; D-phenylglycine; anticancer activity; synthesis

O624.33

：A

：1008-2395(2013)06-0028-04

2013-09-04

房立杰（1988-），女，碩士研究生，研究方向：藥物合成。

趙龍鉉（1967-），男，教授，研究方向：藥物合成。