劉 巍，丁學(xué)知*，夏立秋，孫運(yùn)軍，禹智輝，肖秀情，羅超枝，黃少亞

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410081)

劉 巍，丁學(xué)知*，夏立秋，孫運(yùn)軍，禹智輝，肖秀情，羅超枝，黃少亞

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410081)

利用Tris-HCl(pH7.5，100mmol/L)提取藠頭總蛋白質(zhì)，用不同飽和度硫酸銨鹽析沉淀，檢測飽和硫酸銨鹽析后藠頭蛋白質(zhì)對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明：20%～80%飽和硫酸銨鹽析制備的藠頭蛋白質(zhì)對白色念球菌、小鼠黑色素瘤細(xì)胞的生長均有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)，其中80%飽和硫酸銨鹽析制備藠頭總蛋白質(zhì)抗菌抗腫瘤活性最為明顯。藠頭蛋白質(zhì)經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測，其主要成分為凝集素、熱休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和腫瘤壞死因子受體蛋白等物質(zhì)。

藠頭；蛋白質(zhì)；黑色素瘤；抗腫瘤作用；液相色譜-質(zhì)譜

藠頭又稱薤白(Allium chinense)，為百合科蔥屬植物，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗菌消炎、解痙平喘、抗血小板聚集等作用，常被作為一種有效的抗癌輔助性藥物，用于臨床治療肺癌、胃癌、乳腺癌等，但其有效成分尚不清楚[1-3]。目前已有研究表明藠頭多糖能消除羥自由基和抗DNA損傷[4-6]，藠頭中的硫化物具有廣譜抗菌作用[7]。藠頭多糖和含硫化合物的抗菌抗腫瘤活性已有一些報(bào)道[8-9]，但對其蛋白質(zhì)組分的抗腫瘤活性研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用不同飽和度硫酸銨溶液鹽析制備藠頭蛋白質(zhì)，研究其對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞的抑制作用，并對其成分進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藠頭 長沙市農(nóng)貿(mào)市場特定農(nóng)戶購買。

1mol/L Tris-HCl(pH8) 帕弗瑞生物技術(shù)(北京)有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；MTT試劑盒、二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞株

細(xì)胞株：B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞，Meth-A細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 儀器與設(shè)備

HERA cell 24oiCO2培養(yǎng)箱 美國Forma公司；Leica DMI 倒置顯微鏡 德國Zeiss公司；Centrifuge 5415 R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；AKTA高效液相色譜、YMC pack protein-RP(250mmh4.6mm)反相柱 美國GE公司；FI NNIGAN SURVEYOR四元泵高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、LTQ XL一維線性離子阱質(zhì)譜儀、BioBasic-18反相柱(0.1mmh150mm，5μm)、ZORBAX 300SB-C18預(yù)柱(0. 3mmh5mm，5μm ) 美國熱電公司。

1.4 方法

1.4.1 藠頭總蛋白質(zhì)的制備

將保存于4℃的藠頭取出，加入液氮后以1:1(m/V)的比例加入Tris-HCl(pH7.5，100mmol/L)抽提緩沖液后用組織勻漿機(jī)勻漿，4℃抽提過夜。樣品用4層紗布過濾，濾液經(jīng)9000r/min離心20min，去沉淀，收集上清加20%、40%、60%、80%飽和硫酸銨分別沉淀蛋白質(zhì)過夜。10000r/min離心20min，收集沉淀，用少量0.01mol/L PBS溶解沉淀，10000r/min離心20min，收集上清液脫鹽，Brandford法測定蛋白質(zhì)濃度，—20℃保存待用。

1.4.2 MTT法檢測藠頭蛋白質(zhì)對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞的抑制作用

將小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞密度分別調(diào)整至5.0h104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100μL。加入經(jīng)不同飽和度硫酸銨(20%、40%、60%、80%)鹽析制備的終質(zhì)量濃度分別為20、10、5μg/mL的藠頭蛋白質(zhì)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)PBS的陰性對照組和20μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-FU)陽性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用24h和48h后MTT試劑盒檢測，酶標(biāo)儀于波長450nm處測定各孔吸光度(A450nm)，計(jì)算IC50值。同時(shí)，利用倒置顯微鏡10h10放大倍數(shù)下觀察藠頭蛋白質(zhì)對B16細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞的抑制作用。

1.4.3 藠頭蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析和質(zhì)譜鑒定

對具有抗腫瘤活性的藠頭蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，切除蛋白質(zhì)條帶用胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，LC-MS分析鑒定主要成分。

色譜條件：反相色譜柱BioBasic-18 (0.1mmh 150mm，5μm)，流動(dòng)相A2為H2O+0.1%甲酸，B2為乙腈+ 0.1%甲酸，B22%～90%線性洗脫，洗脫時(shí)間100min，流速200nL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5kV，溫度275℃，毛細(xì)管電壓4.5kV。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫搜尋鑒定：從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中以FASTA格式下載來源于蔥屬植物蛋白質(zhì)作為系統(tǒng)內(nèi)部的數(shù)據(jù)庫來源，一共有128條記錄。采用Sequest搜索引擎(Proteome Discoverer 1.1軟件包的一部分)進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜尋。數(shù)據(jù)庫搜尋采用下列參數(shù)：固定修飾(Cys)，可變修飾選擇氧化(Met)，允許的最大未酶切位點(diǎn)(miss cleavages)數(shù)為2，母離子的質(zhì)量容差(mass tolerances)為1.5，碎片離子的質(zhì)量容差為1.0，只考慮b離子和y離子進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定。同時(shí)進(jìn)行反庫搜索(Target-Decoy Database),輸入適當(dāng)?shù)腦corr vs.charge值，確保假陽性率(FDR)≤0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 藠頭粗蛋白質(zhì)的制備

經(jīng)Tris-HCl溶液提取，飽和硫酸銨鹽析和透析后，Bradford法檢測，從1000g鮮藠頭中得到干質(zhì)量52mg粗蛋白質(zhì)，提取率為0.052%。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示所得粗蛋白質(zhì)為混合物，其成分和鹽析所用硫酸銨飽和度有關(guān)。

2.2 藠頭蛋白質(zhì)對B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用

圖 1 80%硫酸銨制備藠頭蛋白質(zhì)對B16細(xì)胞(a)和Meth-A細(xì)胞的抑制率(b)Fig.1 Inhibition rates of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate against B16 and Meth-A cells

圖 2 80%飽和硫酸銨鹽析所得藠頭蛋白質(zhì)對B16細(xì)胞和Meth-A細(xì)胞的抑制作用(×100)Fig.2 Microscopic observation of inhibitory effect of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate against B16 and Meth-A cells (× 100)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20%～80%硫酸銨鹽析得到的藠頭蛋白質(zhì)對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用，其中80%硫酸銨鹽析得到的蛋白質(zhì)樣品對腫瘤細(xì)胞抑制作用最明顯，由圖1a、b可知，藠頭蛋白質(zhì)對B16和Meth-A細(xì)胞的IC50值在24h時(shí)分別為7.834μg/mL和9.55μg/mL，48h時(shí)為11.3μg/mL和13.0μg/mL。通過對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藠頭蛋白質(zhì)作用后，腫瘤細(xì)胞在凋亡過程中出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，且凝集度隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高而增加(圖2)。

2.3 藠頭蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

藠頭提取液經(jīng)不同飽和度硫酸銨鹽析所得蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖3)，切取主要膠帶胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，1D-LC-MS鑒定(表1)，其主要成分為蒜氨酸酶、熱休克蛋白、凝集素、半胱氨酸合酶、腫瘤壞死因子受體家族蛋白等。

圖 3 SDS-PAGE電泳檢測藠頭蛋白Fig.3 SDS-PAGE of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate

表 1藠頭蛋白質(zhì)的LC-MS鑒定Table 1 LC-MS analysis of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate

3 討 論

3.1 藠頭蛋白質(zhì)抗腫瘤活性研究

不同飽和度硫酸銨鹽析得到的藠頭總蛋白質(zhì)的主要成分不同。1D-LC-MS分析藠頭蛋白質(zhì)成分，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果和NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)藠頭蛋白的主要成分為凝集素、熱休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和腫瘤壞死因子受體蛋白等物質(zhì)。不同飽和度硫酸銨鹽析蛋白質(zhì)對腫瘤細(xì)胞作用結(jié)果顯示，隨著鹽析硫酸銨飽和度的升高得到的蛋白質(zhì)抗腫瘤活性越強(qiáng)，其中抗腫瘤活性最強(qiáng)的80%飽和度硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)主要成分是20kD以下的小分子物質(zhì)凝集素，這和已有關(guān)于凝集素具有抗腫瘤活性的報(bào)道相印證。

3.2 藠頭蛋白的可能作用機(jī)理

藠頭蛋白質(zhì)經(jīng)1D-LC-MS鑒定發(fā)現(xiàn)其主要活性成分為凝集素、熱休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和腫瘤壞死因子受體蛋白。蒜氨酸酶可催化蒜氨酸分解為大蒜素等硫化物，大蒜素目前已經(jīng)被證明具有廣泛的抗菌抗腫瘤作用，目前在臨床中已有應(yīng)用[10-12]。凝集素是一類具有糖專一性、可使細(xì)胞凝集的糖蛋白。它能與糖專一性、非共價(jià)可逆結(jié)合，廣泛存在于植物、動(dòng)物等生物的細(xì)胞膜上、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)中，具有促使細(xì)胞凝集、細(xì)胞有絲分裂、防御害蟲危害、消除入侵微生物等生理功能。目前研究表明凝集素對腫瘤細(xì)胞具有凝集作用，凝集素構(gòu)成的免疫毒素對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用[13]。文獻(xiàn)[14]報(bào)道蓖麻毒蛋白能通過誘導(dǎo)DNA斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

隨著藠頭蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高腫瘤細(xì)胞凝集現(xiàn)象越明顯，本實(shí)驗(yàn)室此前的研究結(jié)果曾報(bào)道腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過藠頭提取物作用后DNA發(fā)生斷裂[15]，這和文獻(xiàn)報(bào)道的凝集素對腫瘤細(xì)胞的作用結(jié)果相似。同時(shí)文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道從藠頭鱗莖中提取的活性物能通過對腫瘤細(xì)胞周期的影響來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定到一些能通過影響細(xì)胞周期和調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的蛋白質(zhì)，可能與藠頭活性物具備抗腫瘤活性有關(guān)。當(dāng)然，藠頭中各類蛋白質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用機(jī)制和對腫瘤細(xì)胞周期的影響需要進(jìn)一步研究。

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Isolation and Antitumor Activity of Proteins from Allium chinense Bulbs

LIU Wei，DING Xue-zhi*， XIA Li-qiu，SUN Yun-jun，YU Zhi-hui，XIAO Xiu-qing，LUO Chao-zhi，HUANG Shao-ya
(Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

Allium chinense bulbs were extracted with pH 7.5 100 mmol/L Tris-HCl buffer solution and salted out with ammonium sulfate at different degrees of saturation to obtain total proteins. The antitumor activity of total protein extracts against mouse B16 melanoma cells and Meth-A cells was tested. Protein extracts obtained with 20%ü80% saturated ammonium sulfate had potent cytotoxicity against both tumor cells and protein extract with the most potent cytotoxicity was obtained with 80% saturated ammonium sulfate, which mainly consisted of alliinase, heat shock protein, lectin, cysteine synthase and members of the tumor necrosis factor receptor super family as shown by LC-MS analysis.

Allium chinenese；protein；melanoma；anti-tumor；LC-MS

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0300-03

2011-10-19

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010 FJ 2002)；長沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目(k0802102-31)

劉巍(1986ü)，男，碩士研究生，主要從事微生物生物化學(xué)研究。E-mail：koosy2000@163.com

*通信作者：丁學(xué)知(1954ü)，女，教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：dingxuezhi@hunnu.edu.cn