鐘 華 曹傳旺 薛 煜 嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

舞毒蛾(Lymantria dispar)屬鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantridae)，是一種食性廣譜的食葉害蟲，能取食500 多種植物，主要為害楊、柳、櫟、榆、桑、樺、油杉、沙棘、落葉松、蘋果、梨、杏、桃、柑桔、山楂等樹木［1－3］，給農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重的損失。甲氧蟲酰肼屬于酰肼類擬蛻皮激素類殺蟲劑，能模擬20 －羥基蛻皮激素與目標(biāo)害蟲蛻皮激素受體復(fù)合物相互作用，以蛻皮激素的作用方式導(dǎo)致昆蟲致死性蛻皮［4］。該藥劑對(duì)鱗翅目昆蟲具有高度的選擇毒性，對(duì)非靶標(biāo)生物以及環(huán)境安全，已經(jīng)成為防治蔬菜、棉花、玉米及其他農(nóng)作物上多種鱗翅目害蟲的理想藥劑［5］。害蟲對(duì)殺蟲劑的氧化代謝，在其抗藥性形成中起重要作用。其中，多功能氧化酶(MFOs)能夠催化各種結(jié)構(gòu)不同的內(nèi)源或外源化合物氧化，如:脂肪酸、甾體激素、藥物、殺蟲劑及各種環(huán)境有害化合物等［6］。王建軍［7］等研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量甲氧蟲酰肼對(duì)斜紋夜蛾MFOs 具有一定的誘導(dǎo)作用。廖月枝等［8－9］研究表明甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶、MFOs、谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶活性及不同組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)。甲氧蟲酰肼分子結(jié)構(gòu)中含有芳基酰胺結(jié)構(gòu)，而廣泛存在于昆蟲體內(nèi)的酰胺酶則被認(rèn)為可能參與帶有這類結(jié)構(gòu)的某些農(nóng)藥的水解作用，在昆蟲對(duì)具有此類結(jié)構(gòu)的殺蟲劑抗性中可能起著重要作用［10］。劉玉娣等［11］報(bào)道指出小菜蛾對(duì)抑太保的敏感性差異較大，并且其體內(nèi)羧基酰胺酶的活力會(huì)隨著溫度及蟲齡的變化而改變。但迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)甲氧蟲酰肼對(duì)羧基酰胺酶活性的影響研究報(bào)道較少。筆者研究甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲MFOs 及其酰胺酶活性的影響，為明確甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾的毒理分子機(jī)制及開發(fā)新型蛻皮激素類似物提供理論依據(jù)，以便在林間合理防治舞毒蛾的危害。

1 材料與方法

供試?yán)ハx:2010年3月在東北林業(yè)大學(xué)校園及其示范林場(chǎng)內(nèi)采集舞毒蛾卵塊，將卵塊置于人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，用人工飼料飼養(yǎng)幼蟲，每天觀察幼蟲生長發(fā)育和蛻皮情況，3 ～4 d 更換一次飼料，及時(shí)清理幼蟲的排泄物和食物殘?jiān)：銣仫曫B(yǎng)條件為溫度(25 ±1)℃，相對(duì)濕度60% ～80%，光周期16 h 光照、8 h 黑暗。

供試藥劑:98%甲氧蟲酰肼原藥，美國陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)品，配置為100 mol·L－1的母液。乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G －250、氫氧化鋇、硫酸鋅，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對(duì)硝基苯甲醚、苯甲基磺酰氟、二硫蘇糖醇、硫脲、對(duì)硝基乙酰苯胺，美國Sigma 公司;還原型輔酶Ⅱ四鈉，瑞士Rocha 公司;磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉及其他試劑均為分析純。

毒力測(cè)定:采用葉片藥膜法［12－13］。甲氧蟲酰肼用丙酮液(V(丙酮)∶ V(蒸餾水)=2∶ 1)作為溶劑配成100 mol·L－1母液，之后用蒸餾水稀釋成0.1、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、50.0 mol·L－1，每個(gè)梯度中丙酮溶劑含量均小于1%，以蒸餾水處理作為對(duì)照。將未接觸過任何藥劑的白樺葉片浸入稀釋好的藥液中，10 s 后取出，置于陰涼處晾干。用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放入透氣性良好的塑料培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中。將健康、大小一致，且饑餓12 h 的2、3 齡舞毒蛾幼蟲接到白樺葉片上，每齡每皿放入10 頭，每齡每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次。置于人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，48 h 后檢查死亡數(shù)，以毛筆輕觸幼蟲不能活動(dòng)視為死亡。

亞致死濃度處理:根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果，選用甲氧蟲酰肼48 h 的LC5和LC20劑量處理白樺葉片，飼喂健康、大小一致，且饑餓12 h 的2、3 齡舞毒蛾幼蟲，每齡每皿放入10 頭，處理方法和飼養(yǎng)條件同毒力測(cè)定，以蒸餾水處理作對(duì)照。處理6、12、24、48、72 h后，分別挑選活潑的2、3齡舞毒蛾幼蟲，于冰箱中－80 ℃儲(chǔ)存，用于酶活性測(cè)定。

酶活性測(cè)定:在用甲氧蟲酰肼處理后不同時(shí)間，每一處理每一重復(fù)取5 ～10 頭幼蟲，整體勻漿，測(cè)定不同處理時(shí)間MFOs 和羧基酰胺酶的活性。MFOs活性測(cè)定參考Hansen 等的方法［14］略作修改。取4×10－3mol·L－1對(duì)硝基苯甲醚1.0 mL，0.1 mol·L－1pH 值7.8 的磷酸緩沖液0.8 mL，5 ×10－4mol·L－1NADPH－Na40.2 mL 和酶液1.0 mL，以等體積的0.1 mol·L－1pH 值7.8 的磷酸緩沖液作對(duì)照，搖勻置于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，然后在反應(yīng)體系中加入1.0 mol·L－1鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)，再加入5.0 mL 氯仿萃取，靜止10 min 后，在氯仿層移取3.0 mL 到另一組試管內(nèi)，再加入0.5 mol·L－1氫氧化鈉3.0 mL溶液萃取，靜止10 min，取水相2.0 mL 于比色皿中，于400 nm 處測(cè)定OD 值。酶活力單位以mol·g－1·min－1表示。羧基酰胺酶活性測(cè)定參考Erlenger等的方法［15］略作修改。5 mL 反應(yīng)體系中含有2 mL酶液(1 mg 蛋白)，0.1 mol·L－1pH 值7.5 的磷酸緩沖液2.9 mL，0.1 mL 5 g·L－1對(duì)硝基乙酰苯胺。用煮死的酶液作為對(duì)照。反應(yīng)混合物于30 ℃恒溫水浴鍋中震蕩溫育30 min，將反應(yīng)管于沸水中放置10 min 以終止反應(yīng)，然后向所有反應(yīng)管中加入1 mL 0.15 mol·L－1氫氧化鋇和0.15 mol·L－1硫酸鋅去除蛋白;于0 ℃、10 000 r/min 下離心15 min，吸取上清液在405 nm 處測(cè)定OD 值。酶活力單位以mol·g－1·min－1表示。酶的比活力(U/mg)=酶活力/蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定:采用Bradford 考馬斯亮藍(lán)G－250 法［16］。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析:利用POLO 軟件處理分析毒力測(cè)定結(jié)果，計(jì)算致死中濃度(LC50)和亞致死濃度(LC5和LC20)及其95%置信區(qū)間;采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用LSD 法，顯著水平p=0.05 或p=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲的毒力

甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲致死中濃度及其95%置信區(qū)間見表1。甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾2、3 齡幼蟲均表現(xiàn)出較高的活性，2 齡幼蟲對(duì)藥劑較為敏感，48 h LC50為14.004 mol·L－1，而3 齡幼蟲48 h LC50則為24.105 mol·L－1。隨著齡期的增長，所需藥量增加，但是隨著處理時(shí)間的延長，LC50逐漸降低，96 h 時(shí)，2、3 齡幼蟲LC50分別降至2.150、2.835 mol·L－1。

2.2 甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲MFOs 活性的影響

甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾2 齡幼蟲MFOs 活性的影響見表2。72 h 內(nèi)，LC5與LC20劑量下的甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾2 齡幼蟲體內(nèi)MFOs 活性都具有先激活再抑制再激活的作用。處理6 h 時(shí)，處理組MFOs 活性均顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.867、2.000倍(p ＜0.01);在處理12、24 h 時(shí)，MFOs 活性被抑制，其中LC5劑量下24 h 抑制作用最強(qiáng)，僅為對(duì)照的0.452 倍，與對(duì)照差異顯著(p ＜0.05);LC20劑量下12 h 抑制作用達(dá)到最大，為對(duì)照的0.500 倍，與對(duì)照差異顯著(p ＜0.05)。從處理48 h 開始，甲氧蟲酰肼對(duì)MFOs 活性具有明顯的激活作用，且均在處理72 h 時(shí)，LC5與LC20劑量對(duì)MFOs 的激活作用最強(qiáng)，分別為對(duì)照的6.143、4.571 倍，隨著時(shí)間的延長，藥劑對(duì)該酶激活作用呈上升趨勢(shì)。

表1 甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲的毒力 mol·L －1

表2 亞致死劑量甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲MFOs 活性的影響

由表2可以看出，甲氧蟲酰肼LC5和LC20對(duì)舞毒蛾3 齡幼蟲體內(nèi)MFOs 活性的影響與對(duì)2 齡幼蟲該酶活性的影響具有相反的趨勢(shì)，即對(duì)MFOs 活性具有先抑制再激活再抑制的作用。處理6 h 時(shí)，MFOs 活性被抑制;處理12 h 時(shí)，MFOs 活性有所上升;處理后24 ～72 h，MFOs 活性再次被抑制，其中24 h 抑制作用最強(qiáng)，LC5和LC20處理下MFOs 活性分別為對(duì)照的0.160、0.115 倍，均與對(duì)照差異極顯著(p ＜0.01)。

2.3 甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲羧基酰胺酶活性的影響

從表3可以看出，用甲氧蟲酰肼48 h LC5和LC202 種劑量處理后，舞毒蛾2、3 齡幼蟲體內(nèi)羧基酰胺酶呈激活—抑制—激活—抑制的曲線波動(dòng):處理6 h 時(shí)，羧基酰胺酶的活性明顯被激活;至12 h 時(shí)，羧基酰胺酶活性隨之被抑制;處理后24 ～48 h，該酶活性被再次激活，其中24 h 2 種劑量激活作用均達(dá)到最強(qiáng)。24 h 時(shí)，LC5劑量對(duì)舞毒蛾2、3 齡幼蟲激活作用分別為對(duì)照的1.409、1.148 倍，LC20劑量分別為對(duì)照的1.264、1.148 倍，均與對(duì)照差異極顯著(p ＜0.01)。隨著處理時(shí)間的延長，處理72 h 時(shí)，2種劑量對(duì)羧基酰胺酶的活性均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用。72 h 時(shí)，LC5劑量下2、3 齡幼蟲的羧基酰胺酶活性分別為對(duì)照的0.668、0.729 倍，LC20劑量分別為對(duì)照的0.724、0.729 倍，均與對(duì)照差異極顯著(p ＜0.01)。

表3 亞致死劑量甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲羧基酰胺酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

多功能氧化酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，在殺蟲劑代謝、昆蟲抗藥性等方面都具有重要作用［17－18］。王建軍等［7］在室內(nèi)研究了甲氧蟲酰肼對(duì)斜紋夜蛾亞致死效應(yīng)，結(jié)果表明甲氧蟲酰肼對(duì)MFOs 具有一定的誘導(dǎo)作用。廖月枝等［8］報(bào)道甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾4、6 齡幼蟲MFOs 表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，甲氧蟲酰肼LC5和LC20對(duì)舞毒蛾2 齡幼蟲MFOs 活性均表現(xiàn)出先激活再抑制再激活效應(yīng)，處理初期MFOs 活性被誘導(dǎo)激活，增強(qiáng)水解代謝達(dá)到解毒的目的;隨著處理時(shí)間的延長，當(dāng)藥劑在幼蟲體內(nèi)含量增加后，該酶活性逐漸被抑制，降低了幼蟲對(duì)該藥劑的解毒作用。2 種劑量對(duì)舞毒蛾3 齡幼蟲MFOs 的影響與2 齡幼蟲具有相反的趨勢(shì)，這與鄢杰明等［9］研究發(fā)現(xiàn)LC50劑量甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾3 齡幼蟲體內(nèi)的MFOs 表現(xiàn)為先抑制后激活的作用具有一致性。這些變化都表明甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內(nèi)MFOs 活性具有一定的干擾作用。昆蟲對(duì)具有酰胺鍵的某些有機(jī)磷化合物(如樂果)的抗性是由于對(duì)酰胺酶的誘導(dǎo)形成。Metcalf 等［19］報(bào)道鹽澤燈蛾幼蟲及蚊幼蟲對(duì)滅幼脲的降解，發(fā)生于滅幼脲分子中的酰胺鍵位點(diǎn)。吳剛等［20］研究證實(shí)小菜蛾體內(nèi)酰胺酶對(duì)抑太保的降解作用，可能是導(dǎo)致其對(duì)抑太保產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。根據(jù)筆者的試驗(yàn)結(jié)果，甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內(nèi)羧基酰胺酶影響存在明顯的時(shí)間效應(yīng)，具有類似的變化趨勢(shì)，即表現(xiàn)出激活—抑制—激活—抑制的趨勢(shì)，2 種劑量在24 h 對(duì)羧基酰胺酶的激活作用均達(dá)到最強(qiáng)，在72 h 對(duì)羧基酰胺酶的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)。說明甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內(nèi)羧基酰胺酶的活性，從而干擾羧基酰胺酶對(duì)甲氧蟲酰肼的降解作用。綜上所述，甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾低齡幼蟲體內(nèi)MFOs和羧基酰胺酶的活性，干擾對(duì)甲氧蟲酰肼的降解作用，有效防治舞毒蛾。

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