李學(xué)慶 鄒文俊

參姜膠囊(簡稱SJ)是以姜黃、人參2種中草藥有效部位群姜黃素、人參皂甙以固定比例組成的復(fù)方制劑，具有扶正祛邪、活血通經(jīng)止痛功效。SJ臨床對(duì)多種腫瘤有抑制作用，文獻(xiàn)研究SJ主藥姜黃素(CUR)、人參皂甙(SPFG)有廣泛的藥理作用［1-2］。本文從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面對(duì)SJ抗腫瘤作用進(jìn)行了研究。根據(jù)小鼠與人類體表面積比等效劑量換算比率表，設(shè)定高、中、低3個(gè)劑量為抗小鼠肝腹水癌H22、小鼠肉瘤S180腫瘤治療量，在體外測定CUR、SPFG對(duì)N-04神經(jīng)癌、LU-04肺癌、BRE-01乳腺癌腫瘤細(xì)胞的IC50，研究其抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)藥物:SJ由自主研制，經(jīng)硅膠薄層鑒定，其主藥成分與標(biāo)準(zhǔn)品的比移值相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.2%羧甲基纖維素鈉(CMC)配制成高、中、低(240 mg/kg，120 mg/kg，60 mg/kg)濃度混懸水溶液。環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞，批號(hào):11061821);5-氟尿嘧啶(5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)，批號(hào):fa11010);0.9%生理鹽水(NS.四川科倫，批號(hào):a11042802)。722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);酶標(biāo)儀550，96孔板清洗機(jī)為BIORAD產(chǎn)品;微量振蕩器(上海醫(yī)療儀器廠);多通道可調(diào)移液器10～200 μl;倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。SRB、MTT為SIGAMA公司產(chǎn)品;PBS清洗液;消化液(0.02%EDTA加0.25%胰酶等體積混合);二甲亞砜(DMSO)(分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠)。昆明種二級(jí)小鼠，體重19～21 g，♀♂各半，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第162號(hào)，飼養(yǎng)室溫度(20℃ ±2℃)。腫瘤株:鼠肉瘤S180、小鼠肝癌H22(腹水型)由四川腫瘤研究所提供;人肺癌細(xì)胞LU-02、結(jié)腸癌細(xì)胞COL-05、乳腺癌細(xì)胞BRE-01為成都地奧篩選中心保種，用含10%小牛血清(上海輕工所)100 IU/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(GlBCO產(chǎn)品)培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 SJ對(duì)移植性小鼠肝癌H22腫瘤抑瘤實(shí)驗(yàn)［3］

60只昆明小鼠，♀♂各半，瘤株接種按常規(guī)，在無菌條件下抽取荷瘤鼠腹腔瘤液，用生理鹽水(NS)以1∶4倍稀釋，調(diào)細(xì)胞數(shù)為 107個(gè)/ml，計(jì)活細(xì)胞數(shù) ＞95%，取0.2 ml瘤液注射入小鼠右腋皮下，接種瘤珠24 h后，隨機(jī)分為5組:NS對(duì)照組、5-Fu組、SJ高劑量組、SJ中劑量組、SJ低劑量組，化療各組分別按0.1 ml/10 g，腹腔注射5-Fu(15 mg/10 ml);SJ 3個(gè)劑量組，同體積不同濃度(0.1 ml/10 g)灌胃給藥，NS對(duì)照組給予同體積0.9%生理鹽水，均于治療的第11天稱重，處死小鼠，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率(%)=［(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重］。

1.3 SJ對(duì)移植性小鼠肉瘤S180的抑瘤實(shí)驗(yàn)

60只昆明小鼠，♀♂各半，接種瘤株后，隨機(jī)分為5組:NS對(duì)照組、CTX組、SJ高劑量組、SJ中劑量組、SJ低劑量組?；煾鹘M分別按0.1 ml/10 g、腹腔注射CTX(15 mg/10 ml);其余操作方法同小鼠肝癌的腫瘤試驗(yàn)。

1.4 SJ體外抗人腫瘤實(shí)驗(yàn)［4］

取成對(duì)數(shù)生長的N-04神經(jīng)癌、LU-04肺癌、BRE-01乳腺癌細(xì)胞消化、記數(shù)分別以7 500/ml、15 000/ml、10 000/ml接種于96孔板，上下邊緣孔空出，37℃培養(yǎng)24 h，用移液器吸出培養(yǎng)液，然后加入一定量新培養(yǎng)液，參照EXCEL抗腫瘤藥物篩選模板，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，加入 SJ主藥成分 CUR 100 μg/ml、SPFG 200 μg/ml，并且10倍稀釋至5個(gè)梯度(此時(shí)，測T0對(duì)照板用TCA固定)繼續(xù)培養(yǎng)48h，50%TCA固定60min，SRB染色，10 min后，1%醋酸清洗5次加TRIS 200 μl振蕩器震蕩，比色540 nm，根據(jù)IC50模板測OD值，取均值，采用logist法計(jì)算 IC50(μg/ml)，IC50＜20 μg/ml表明 SJ對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用［5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件包(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室提供)處理。數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

SJ對(duì)小鼠肝癌H22和S180均有抑瘤作用，結(jié)果見表1、表2，SJ高、中、低劑量組對(duì)小鼠肝癌的抑瘤率分別為 50.34%、46.96%、18.92%，5-Fu 抑瘤率為52.23%，以上各受試藥物與肝癌對(duì)照組比較，SJ低劑量組差異不顯著，P＞0.05;其他各組均有顯著差異，P＜0.01;SJ高、中、低劑量組對(duì)小鼠S180抑瘤率分別為51.56%、42.91%、29.23%，CTX 抑瘤率為 57.05%，以上各受試藥物與肝癌對(duì)照組比較，SJ低劑量組差異不顯著，P ＞0.05，其他各組均有顯著差異，P ＜0.01。SJ體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，SJ有效部位群CUR對(duì)LU-02、COL-05、BRE-01 的 IC50均小于 20 μg/ml，IC50分別為 18.89 μg/ml、8.33 μg/ml、12.5 μg/ml;SPFG對(duì)LU-02、COL-05、BRE-01 的 IC50均大于20 μg/ml。結(jié)果表明，SJ對(duì)小鼠肝癌、S180實(shí)體瘤均有明顯抑瘤作用，SJ有效成分 CUR體外對(duì)人 LU-02、COL-05、BRE-01癌細(xì)胞有抑制作用，表明SJ對(duì)多種腫瘤有抑制作用。

表1 SJ對(duì)小鼠H22實(shí)體瘤的抑瘤作用

表2 SJ對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用

表3 SJ體外抑瘤作用

3 討論

本研究表明，SJ對(duì)小鼠H22、S180有抑制作用，并且SJ組活動(dòng)能力及皮毛光華度要好于5-Fu、CTX對(duì)照組;治療組移植腫瘤明顯小于對(duì)照組，SJ對(duì)腫瘤的抑制表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，隨劑量增加，抑制作用增強(qiáng)。在體外實(shí)驗(yàn)研究中SJ及其有效成分對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷抑制作用。

SJ的有效成分為CUR、SPFG，其藥理作用廣泛，對(duì)多種疾病有治療作用。研究報(bào)道姜黃素(CUR)具有降血脂，清除自由基作用，可預(yù)防腫瘤的發(fā)生，文獻(xiàn)報(bào)道注射組50 mg/kg·d，CUR對(duì)S180腫瘤抑制率高達(dá)76%，明顯高于口服給藥組，并認(rèn)為其具有抑制血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤作用，本研究發(fā)現(xiàn)口服給藥抑瘤率可達(dá)50%左右而體外實(shí)驗(yàn)抑瘤率可達(dá)75%，與文獻(xiàn)報(bào)道的相符［6］，而且對(duì)腫瘤有直接殺傷作用的成分為CUR。

中藥可減輕化療藥的毒副作用，可增加腫瘤對(duì)化療藥的敏感性，人參及其有效成分的研究多有報(bào)道，人參皂苷具有提高人體免疫力、促進(jìn)物質(zhì)代謝、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等作用，人參皂苷與化學(xué)藥物的聯(lián)合運(yùn)用，增強(qiáng)療效的同時(shí)能有效降低化學(xué)藥物的毒副作用，此亦為中醫(yī)學(xué)與西方醫(yī)學(xué)相結(jié)合的發(fā)展［7］。人參皂苷在臨床應(yīng)用中療效確切，人參皂甙(SPFG)中人參皂苷Rg3對(duì)多種腫瘤均顯示了抗腫瘤作用［8］，已經(jīng)在臨床有廣泛應(yīng)用，其作用機(jī)理是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖、影響蛋白和基因的表達(dá)等方式而抑制腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、生長、并抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲［9］。人參皂苷Rg3有聯(lián)合化療增效減毒、抑制腫瘤血管新生、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等諸多方面藥理作用［10］。

復(fù)方是中醫(yī)藥的特點(diǎn)之一，可通過多靶點(diǎn)發(fā)揮作用提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量，SJ在增強(qiáng)抗應(yīng)激性和抗腫瘤發(fā)揮療效，中藥對(duì)化療藥減毒、增效作用是其特點(diǎn)，SJ對(duì)化療藥的協(xié)同作用還有待深入研究。

隨著腫瘤發(fā)病率的不斷升高，臨床急需用于預(yù)防腫瘤的安全藥品，SJ組方是安全的防治腫瘤藥物，姜黃與人參在食品與保健品中應(yīng)用廣泛，在用量合理范圍內(nèi)安全可靠，SJ制劑在急性毒性實(shí)驗(yàn)中未檢測出致死量，在臨床防治腫瘤及輔助化療治療中應(yīng)該有廣泛的應(yīng)用前景，由于其給藥途徑及劑型需要考慮便利性、療效等多方面因素，在化學(xué)、劑型、藥理等方面還有必要進(jìn)行深入研究。

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