孔令韜，吳 楓，湯艷清

抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩、興趣喪失、精力缺乏為主要臨床表現(xiàn)，伴有食欲減退、體質(zhì)量減輕及睡眠障礙等軀體癥狀的常見精神疾病。應(yīng)激性生活事件與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)，隨著現(xiàn)代社會人們生活壓力的增加，抑郁癥發(fā)病率逐漸升高，預(yù)計到2020年抑郁癥將成為年發(fā)病率位居第2位的疾?。?］。但目前抑郁癥的病因仍不清楚，對其發(fā)病的病理生理學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的作用機(jī)制等方面的研究仍存在著巨大空白。

凋亡是一種受基因調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡，是成年生物體內(nèi)主動清除病變和衰老細(xì)胞，保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的重要生物過程，與機(jī)體發(fā)育、組織自穩(wěn)定及多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)［2］。近年來的神經(jīng)生物學(xué)研究表明，應(yīng)激導(dǎo)致的海馬損傷和海馬神經(jīng)元凋亡增加可能是抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在病理生理機(jī)制之一［3］。細(xì)胞色素C是一種調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，但其在應(yīng)激導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡過程中的作用及抗抑郁藥物對其表達(dá)的影響尚不清楚。本研究旨在觀察慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬組織細(xì)胞色素C的表達(dá)并探討兩種不同作用機(jī)制抗抑郁藥物氟西汀和噻萘普汀的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組 雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，自由飲食水，光暗周期為12 h/12 h，實(shí)驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。采用隨機(jī)排列表法將大鼠分為對照組、模型組、氟西汀組和噻萘普汀組，每組15只。

1.2 主要儀器及試劑 德國Heidolph公司Diax 900型電動組織勻漿機(jī)，德國西格瑪公司Sigma 2－16K型低溫超速離心機(jī)。兔抗大鼠細(xì)胞色素C抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，化學(xué)發(fā)光 (ECL)試劑盒購自美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 第1～21天，對照組大鼠正常飼養(yǎng)，模型組、氟西汀組和噻萘普汀組大鼠隨機(jī)接受7種不同的刺激:電擊足底 (30～40 V，20 s/次，間隔1 min，共20次);強(qiáng)迫游泳 (水溫20℃，5 min);夾尾 (1 min);搖晃 (水平往復(fù)，1次/s，共15 min);熱應(yīng)激 (45℃恒溫箱，5 min);禁食 (48 h);禁水 (24 h)。每天給予1種刺激，每種刺激累計使用2～3 次［4］。

1.3.2 藥物干預(yù) 模型制備期間對大鼠進(jìn)行刺激前，氟西汀組大鼠采用氟西汀 (20.0 mg/片)10.0 mg/kg灌胃，噻萘普汀組大鼠采用噻萘普汀 (12.5 mg/片)50.0 mg/kg灌胃，對照組和模型組大鼠采用等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。氟西汀和噻萘普汀使用前先研磨成粉并溶于蒸餾水。

1.3.3 細(xì)胞色素C表達(dá)水平 第22天將各組大鼠斷頭處死，迅速取腦并剝離海馬組織，4℃保存，加入300 μl裂解液勻漿并在低溫離心機(jī)離心，離心半徑 (r)=10 cm，25 000×g，15 000 r/min離心1 h，吸取上清液待測。

采用蛋白印跡法 (Western Blot法)測定細(xì)胞色素C的表達(dá)，步驟如下:(1)考馬斯亮藍(lán)G250法測定細(xì)胞色素C水平并加入樣品緩沖液;(2)灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液4℃過夜;(3)加入1∶200稀釋的兔抗大鼠細(xì)胞色素C抗體，搖床上室溫孵育2 h;(4)加入1:400稀釋的與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG，搖床上室溫孵育2 h;(5)ECL法顯色;(6)曝光，顯影，定影。采用Chemi Imager 5500 V 2.03軟件掃描Western Blot法測定的結(jié)果，F(xiàn)luor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析，細(xì)胞色素C表達(dá)水平以整合光密度值 (IDV)表示。

1.3.4 行為學(xué)觀察指標(biāo) 采用開場法測定各組大鼠模型制備前后5 min內(nèi)的行為學(xué)觀察指標(biāo)，包括水平穿越格數(shù) (大鼠由中央格開始跑動穿過的格數(shù))、豎立次數(shù) (大鼠前爪同時離開地面超過1 s的次數(shù))、修飾次數(shù) (大鼠用前爪整理胡須的次數(shù));之后進(jìn)行液體消耗實(shí)驗，計算24 h內(nèi)蔗糖水消耗百分比，即蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以 ()表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞色素C表達(dá)水平 對照組大鼠平均IDV值為(24 631±2 194)，模型組為 (38 963±5 384)，氟西汀組為(27 220±2 892)，噻萘普汀組為 (33 204±4 174)，4組大鼠細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=33.343，P=0.000)。其中模型組、氟西汀組、噻萘普汀組細(xì)胞色素C表達(dá)水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為22 151.0、4 001.0和13 250.0，P＜0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=18 150.0，P＜0.01)，與噻萘普汀組比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=9 248.0，P＜0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=8 901.0，P＜0.01)。

2.2 行為學(xué)觀察指標(biāo)比較 4組大鼠模型制備前水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)及蔗糖水消耗百分比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);制備后比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

2.2.1 水平穿越格數(shù) 制備后模型組大鼠水平穿越格數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=35.2，P＜0.05);氟西汀組、噻萘普汀組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為10.7和27.7，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=24.6，P＜0.05)，與噻萘普汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=17.0，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=7.6，P＞0.05)。

2.2.2 豎立次數(shù) 制備后模型組、氟西汀組、噻萘普汀組大鼠豎立次數(shù)與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為18.5、10.7和12.7，P＜0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=8.2，P＜0.05)，與噻萘普汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.0，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=6.2，P＞0.05)。

2.2.3 修飾次數(shù) 制備后模型組、噻萘普汀組大鼠修飾次數(shù)與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為7.4和4.5，P＜0.05);氟西汀組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.3，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=5.1，P＜0.05)，氟西汀組與噻萘普汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.2，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.9，P＞0.05)。

2.2.4 蔗糖水消耗百分比 制備后模型組大鼠蔗糖水消耗百分比與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=0.2，P＜0.05);氟西汀組、噻萘普汀組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為0.04和0.09，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=0.16，P＜0.05)，氟西汀組與噻萘普汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=0.05，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=0.11，P＜0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)觀察指標(biāo)比較 ()Table 1 Comparison of behavior indicators before and after stress in each group

表1 各組大鼠行為學(xué)觀察指標(biāo)比較 ()Table 1 Comparison of behavior indicators before and after stress in each group

.2±3.3 8.4±2.7 70.1±8.7 68.5± 8.2模型組 15 35.3±13.8 23.2±23.0 23.8±5.8 8.1± 7.2 8.8±3.9 3.6±3.5 70.4±6.9 55.4±11.7氟西汀組 15 35.6±13.6 39.1±17.8 24.0±7.4 13.4± 5.0 10.0±4.8 6.9±2.4 72.6±9.1 66.0± 7.3噻萘普汀組 15 38.6±13.6 28.1±23.0 20.5±6.2 12.1± 9.4 7.4±3.4 5.5±3.2 72.8±8.8 62.7±10.6 F制備后對照組 15 37.9±10.9 46.0±18.9 22.6±8.2 20.3±11.3 7組別 只數(shù) 水平穿越格數(shù)(格)制備前 制備后豎立次數(shù)(次)制備前 制備后修飾次數(shù)(次)制備前 制備后蔗糖水消耗百分比(%)制備前0.229 3.297 0.591 5.307 1.030 6.644 0.469 4.551 P值 0.921 0.016 0.671 0.001 0.398 0.000 0.759 0.003值

3 討論

慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激 (CUMS)抑郁模型采用輕度、不可預(yù)見的應(yīng)激因子模擬人類生活事件和環(huán)境應(yīng)激刺激等社會心理因素，與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激原促進(jìn)疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機(jī)制更接近，是近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物藥理學(xué)研究的動物模型之一［4］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠經(jīng)過21 d的慢性綜合應(yīng)激，與對照組大鼠相比，活動能力降低、探究行為、修飾次數(shù)減少，蔗糖水消耗百分比下降，這些表現(xiàn)與臨床上抑郁癥患者表現(xiàn)的精神運(yùn)動改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，而氟西汀組和噻萘普汀組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)均好于模型組，表明模型組大鼠的行為改變可以被抗抑郁藥物拮抗。以上結(jié)果說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制備是成功的［5］。

本研究采用Western Blot法對大鼠海馬組織細(xì)胞色素C表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)過21 d的慢性應(yīng)激后，模型組大鼠海馬組織細(xì)胞色素C表達(dá)水平較對照組升高。細(xì)胞色素C是細(xì)胞線粒體中的一種水溶性蛋白，能夠通過對凋亡信號的傳導(dǎo)和放大作用來調(diào)控細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用:當(dāng)細(xì)胞遭受應(yīng)激反應(yīng)或死亡刺激信號后，細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)中引發(fā)Caspase凋亡通路的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死［6］。研究表明，長期持續(xù)的應(yīng)激刺激會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的生化環(huán)境發(fā)生一系列改變，進(jìn)而顯著增加易感性個體發(fā)生抑郁癥等情感障礙的可能性［7］。海馬是大腦內(nèi)介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)之一，由于海馬神經(jīng)元在應(yīng)激時極易受損，因而在抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究中備受關(guān)注［8－9］。近年研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬的多個亞區(qū)存在神經(jīng)元凋亡，認(rèn)為應(yīng)激導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元受損可能與凋亡有關(guān)［10］。本研究結(jié)果提示，慢性應(yīng)激可能導(dǎo)致海馬部分神經(jīng)元細(xì)胞色素C釋放增加，細(xì)胞色素C的釋放導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡增多進(jìn)而影響海馬功能，這可能是抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在病理生理機(jī)制之一。

本研究采用氟西汀和噻萘普汀兩種不同作用機(jī)制的抗抑郁藥物在大鼠抑郁癥模型制備過程中進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討抗抑郁藥物對神經(jīng)元凋亡過程的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)過21 d的慢性應(yīng)激后，氟西汀組和噻萘普汀組大鼠的細(xì)胞色素C表達(dá)水平均低于模型組，提示抗抑郁藥物能夠抑制神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，減少神經(jīng)元凋亡。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致抑郁模型大鼠海馬組織Bcl－xl表達(dá)降低［11］，環(huán)腺苷酸反應(yīng)成分結(jié)合蛋白 (CREB)能夠增加Bcl－xl的基因表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞存活［12］。在凋亡過程中，B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。?(B cell lymphoma/lewkmia－2，Bcl－2)家族蛋白參與了對線粒體細(xì)胞色素C釋放過程的調(diào)節(jié):凋亡抑制蛋白Bcl－2和Bcl－xl能夠穩(wěn)定線粒體功能，抑制細(xì)胞色素C釋放。另外，氟西汀等新型抗抑郁藥物不僅能通過調(diào)整神經(jīng)元突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)濃度起到抗抑郁效果，而且能夠調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元內(nèi)與神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌有關(guān)的多種信號通路蛋白的表達(dá)，如CREB、蛋白激酶 A(PKA)等［5，13－15］。

綜上所述，抗抑郁藥物可能通過參與多條信號通路的調(diào)節(jié)，上調(diào)凋亡抑制蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)元內(nèi)線粒體細(xì)胞色素C的釋放以減少應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，這種神經(jīng)元保護(hù)作用可能是抗抑郁藥物的作用機(jī)制之一。神經(jīng)元凋亡過程可能與抑郁癥的發(fā)病和治療有關(guān)，對揭示抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在病理生理學(xué)機(jī)制及開發(fā)新型抗抑郁藥物有重要意義，但除細(xì)胞色素C之外，參與凋亡過程的其他相關(guān)蛋白如Apaf－1、Caspase－9等在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁治療過程中的具體作用有待于進(jìn)一步的研究。

1 Saraceno B.The WHO World Health Report 2001 on mental health［J］.Epidemiol Psichiatr Soc，2002，11(2):83－87.

2 Kubera M，Obuchowicz E，Goehler L，et al.In animal models，psychosocial stress－induced(neuro)inflammation，apoptosis and reduced neurogenesis are associated to the onset of depression ［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011，35(3):744 －759.

3 Lucassen PJ，Meerlo P，Naylor AS，et al.Regulation of adult neurogenesis by stress，sleep disruption，exercise and inflammation:implications for depression and antidepressant action ［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2010，20(1):1 －17.

4 Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant［J］.Psychopharmacology(Berl)，1987，93(3):358－364.

5 吳楓，孔令韜，湯艷清.氟西汀和碳酸鋰對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15(6):2055.

6 Hüttemann M，Helling S，Sanderson TH，et al.Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling:cytochrome coxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation ［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1817(4):598－609.

7 Diamond DM，Campbell A，Park CR，et al.Preclinical research on stress，memory，and the brain in the development of pharmacotherapy for depression ［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2004，14(Suppl 5):S491－S495.

8 Jayatissa MN，Bisgaard CF，West MJ，et al.The number of granule cells in rat hippocampus is reduced after chronic mild stress and reestablished after chronic escitalopram treatment［J］.Neuropharmacology，2008，54(3):530－541.

9 Stockmeier CA，Mahajan GJ，Konick LC，et al.Cellular changes in the postmortem hippocampus in major depression ［J］.Biol Psychiatry，2004，56(9):640－650.

10 Duman RS.Synaptic plasticity and mood disorders［J］.Mol Psychiatry，2002，7(Suppl 1):S29－S34.

11 畢波，王哲，彭淼，等.慢性應(yīng)激對大鼠海馬Bcl－xl表達(dá)的影響及應(yīng)激后的變化 ［J］.中國臨床心理學(xué)雜志，2005，13(2):144－146.

12 Rodriguez D，Rojas－Rivera D，Hetz C.Integrating stress signals at the endoplasmic reticulum:the BCL －2 protein family rheostat［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813(4):564－574.

13 孔令韜，吳楓，宋寧，等.慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)及氟西汀的干預(yù)作用［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2008，17(5):391－393.

14 吳楓，李黎黎，孔令韜，等.慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬蛋白激酶A的變化及抗抑郁藥物的干預(yù)作用 ［J］.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2011，5(23):6970－6974.

15 吳楓，孔令韜，湯艷清.抗抑郁藥物對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬蛋白激酶C表達(dá)的干預(yù)作用 ［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15(4):1375.