李云洲 梁 燕 王巧麗 李 翠 崔 霞 秦 蕾

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl vius，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviruses）菜豆金色花葉病毒屬（Begomoviruses），能侵染6科13種植物（Cohen & Nitzany，1966；Cohen et al.，1995；Navas-Castillio et al.，1999；Sánchez-Campos et al.，1999，2000；Ji et al.，2012），主要通過(guò)煙粉虱傳播（Cohen & Antignus，1994；Gafni，2003），感病植株表現(xiàn)明顯矮化，葉緣黃化，葉片變小并卷曲，以植株上部幼嫩葉片癥狀典型，嚴(yán)重危害番茄生長(zhǎng)、開(kāi)花和坐果，導(dǎo)致毀滅性絕產(chǎn)。該病于20世紀(jì)50年代末始發(fā)于以色列，20世紀(jì)90年代以來(lái)，由于全球氣候變暖和煙粉虱的空前擴(kuò)展，該病害在40 多個(gè)國(guó)家大面積暴發(fā)并逐年加重，目前，該病已成為威脅世界番茄生產(chǎn)的主要因素之一（Czosnek & Laterrot，1997）。由于雙生病毒為單鏈DNA 病毒，存在基因重組現(xiàn)象，病毒變異頻率高，越來(lái)越多的此類病毒在世界各地被分離出來(lái)。

迄今為止，世界各地已經(jīng)相繼報(bào)道了幾十個(gè)分離物全序列，根據(jù)分離物地區(qū)不同可分為：TYLCV-Is（以色列番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Sar（撒丁番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Th（泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ye（也門番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ch（中國(guó)番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ng（尼日利亞番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Tz（坦桑尼亞番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-SSA（沙特阿拉伯番茄黃化曲葉病毒）等（Moriones & Navas-Castillo，2000）。目前，該病已遍布我國(guó)各主要番茄主產(chǎn)區(qū)，引起該病的病毒也發(fā)生不同程度的變異。

因此有必要將我國(guó)番茄黃化曲葉病分離物進(jìn)行鑒定、分類，CP基因的同源性是病毒株系劃分主要的依據(jù)之一（Padidam et al.，1999），本試驗(yàn)通過(guò)克隆我國(guó)陜西楊凌（中國(guó)農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)）地區(qū)番茄作物上的TYLCV 外殼蛋白基因，對(duì)其核心序列tCP進(jìn)行測(cè)序和同源性分析，并且根據(jù)核酸同源性進(jìn)行分類，以期為番茄黃化曲葉病抗病育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)于2011年8月～2012年7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取陜西楊凌地區(qū)感病番茄植株生長(zhǎng)點(diǎn)及上部幼嫩葉片，錫箔紙包裹后置液氮冷凍5 min后凍于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體與菌株 pMD18-T 購(gòu)于大連寶生物公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α 購(gòu)自天根生化公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 的提取 采用改良CTAB 法提取番茄植株總DNA（Yan et al.，2008）。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 雙生病毒特異引物（吳劍柄，2008）、CP基因及tCP引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：20 μL ddH2O+20 μL MiX+2 μL PA+2 μL PB+6 μL DNA 模板。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；4℃保存，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后進(jìn)行回收純化（Bio Kete 瓊脂糖凝膠回收試劑盒），用于下一步反應(yīng)。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 由高保真Pfu聚合酶擴(kuò)增得到PCR 產(chǎn)物純化后，用A-tailing 試劑盒加A 尾與pMD18-T 載體連接成pMD18-T+tCP（Pfu聚合酶 pMD18-T 以及A-tailing 試劑盒均購(gòu)于沃爾森生化試劑公司），參照薩布魯克等（1999）所述的熱激法將此連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中，重組子經(jīng)鑒定后送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

表1 用于PCR 擴(kuò)增和測(cè)序的引物序列

1.2.4 序列分析與同源性比較 采用DNAstar 中MegAlign 軟件的ClustalW 方法，將TYLCVCP核心序列tCP進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html 網(wǎng)址完成對(duì)tCP序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物的初步鑒定

根據(jù)吳劍柄（2008）的雙生病毒特異引物PA、PB 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到500 bp 左右的雙生病毒特異產(chǎn)物（圖1），初步斷定所得到的楊凌分離物為雙生病毒，根據(jù)其田間發(fā)病特征：葉片褪綠黃化、變小，葉緣皺縮，葉片增厚，葉質(zhì)變硬，番茄植株矮化生長(zhǎng)停滯，推斷該病毒為番茄黃化曲葉病毒引起，暫時(shí)命名該病毒分離物為TYLCV-Yl（GenBank 序列號(hào)：KC293824）。

2.2 TYLCV-Yl 外殼蛋白全序列的克隆與測(cè)序

為了保證目的片段擴(kuò)增和測(cè)序的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)引物時(shí)在目的片段CP5′和3′端分別延伸350 bp 左右，克隆出的目的片段為1 400 bp（圖2），TYLCV-Yl 外殼蛋白全基因序列如圖3，ATG為起始序列，TAA 為終止序列，共計(jì)777個(gè)核苷酸。該序列與NCBI 中以色列番茄黃化曲葉病毒序列（X15656）基因同源性高達(dá)97%。

圖1 TYLCV-YL 的初步PCR 鑒定結(jié)果

圖2 TYLCV-Yl CP PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 基于CP 蛋白核苷酸序列多重比較

圖4是基于CP蛋白基因的核苷酸序列多重比較結(jié)果，可見(jiàn)編碼CP蛋白基因的5′端高度保守，19個(gè)TYLCV 的起始密碼均為ATG，起始密碼之后最長(zhǎng)的連續(xù)保守序列為TCATTTCCAC。

2.4 TYLCV-Yl 外殼蛋白核心序列tCP 的克隆

圖3 楊凌番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白全基因序列

利用引物tCP-F 和tCP-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到1條420 bp 左右的片段（tCP）（圖5），1～5 點(diǎn)樣孔為同一植株毒源PCR 產(chǎn)物。回收產(chǎn)物進(jìn)行再次驗(yàn)證（圖6），顯示克隆結(jié)果良好。使用Dnstar 軟件分析tCP，其包含1個(gè)開(kāi)放性閱讀框，編碼137個(gè)氨基酸（圖7）。

2.5 tCP 序列特征分析

核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果表明，本試驗(yàn)克隆的TYLCV-YlCP基因與NCBI 中的18個(gè)TYLCV 病毒序列的同源性如表2所示。如圖4所示該tCP基因序列5′端在諸多TYLCV 核酸序列中非常保守。

表2 NCBI 中18個(gè)TYLCV 登錄號(hào)及其CP位點(diǎn)

圖4 19個(gè)TYLCV 的tCP 基于核苷酸序列的多重比對(duì)結(jié)果

圖5 tCP基因片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖6 tCP 回收產(chǎn)物PCR 驗(yàn)證結(jié)果

圖7 楊凌番茄黃化曲葉病毒外殼tCP片段序列及推測(cè)氨基酸序列

tCP核苷酸序列中GC含量為46.28%，預(yù)測(cè)蛋白分子量為15 813.83 D，等電點(diǎn)為11.336?？缒し治鼋Y(jié)構(gòu)顯示（圖8）：tCP具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，該跨膜結(jié)構(gòu)位于79～97個(gè)氨基酸之間。

圖8 tCP 蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將tCP基因序列與NCBI 中已登錄的18種TYLCV 的CP蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖9），這19個(gè)TYLCV CP蛋白序列可以明顯的分為3個(gè)亞組：亞組Ⅰ，亞組Ⅱ，亞組Ⅲ。亞組Ⅰ同源性＞90%，亞組Ⅱ同源性＞80%，亞組Ⅲ同源性＞70%。說(shuō)明CP在TYLCV 進(jìn)化過(guò)程中保守性非常強(qiáng)。其中tCP基因序列被歸為亞組Ⅰ。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，中國(guó)番茄黃化曲葉病由兩個(gè)病毒亞組引起，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV 亞組Ⅱ。

圖9 基于CP基因序列構(gòu)建的分離物TYLCV-YL 與其他株系的系統(tǒng)樹(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將番茄黃化曲葉病毒劃分3個(gè)亞組，中國(guó)境內(nèi)番茄黃化曲葉病毒有2個(gè)亞組，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV 亞組Ⅱ。其中TYLCV 亞組Ⅰ中的TYLCV-Is（以色列）TYLCV 和TYLCV-Sar（意大利撒丁地區(qū)）是最早分離并且報(bào)道其全基因序列的（Kheyr-Pour et al.，1991；Navot et al.，1991）。隨后越來(lái)越多的TYLCV 分離物的全基因組序列被公布。經(jīng)過(guò)序列比較分析，發(fā)現(xiàn)侵染番茄的一系列Begomoviruses病毒親緣關(guān)系或近或遠(yuǎn)，僅用TYLCV 對(duì)這類復(fù)雜的病毒進(jìn)行命名明顯已不恰當(dāng)了。國(guó)際病毒分類委員會(huì)將雙生病毒科病毒全基因組核苷酸序列同源率小于90% 的往往定名為不同病毒（Regenmortel & Fauquet，2000），因此本試驗(yàn)的TYLCV病毒劃分是有科學(xué)依據(jù)的。而且本試驗(yàn)將亞組用于區(qū)分當(dāng)前眾多的TYLCV 分離物，并不是先例，Palukaitis 等（1992）、Rizos 等（1992）曾將亞組用于區(qū)分同CMV 病毒的縱多分離物，這樣根據(jù)病毒核酸序列的同源性將TYLCV 劃分成3個(gè)亞組不僅可以明白諸多TYLCV 病毒的進(jìn)化關(guān)系，也有利于針對(duì)相應(yīng)病毒展開(kāi)防治工作。

本試驗(yàn)結(jié)果可知，中國(guó)番茄黃化曲葉病由兩個(gè)病毒亞組引起，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV亞組Ⅱ，楊凌番茄黃化曲葉病毒（TYLCV-Yl）屬于以色列番茄黃化曲葉病毒株系。一方面說(shuō)明地源近的番茄黃化曲葉病可能由同一病毒亞組引起，如臺(tái)灣番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄黃化曲葉病毒均屬于TYLCV 亞組Ⅱ，另一方面也證明番茄黃化曲葉病毒在中國(guó)境內(nèi)傳播過(guò)程中確實(shí)存在變異。

除此之外，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)中國(guó)境內(nèi)其他TYLCV-CP蛋白的研究，以期為抗病育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。Abel 等（1986）首次將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并成功的獲得了抗煙草花葉病毒TMV 侵染的轉(zhuǎn)基因植株。到目前為止，這一技術(shù)已成功應(yīng)用在十幾個(gè)屬30余種病毒上。同時(shí)CP蛋白作為病毒的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)由ORFν1編碼，Gafni 和Epel（2002）發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白（TYLCV-CP）對(duì)于病毒的侵染和移動(dòng)是非常必要的。Noris 等（1996）也發(fā)現(xiàn)TYLCSV（撒丁番茄黃化曲葉病）CP突變體可以干擾病毒的侵染。而本試驗(yàn)對(duì)TYLCVYlCP核心序列tCP進(jìn)行分析，因?yàn)閠CP有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，一旦該片段缺失，將影響到病毒結(jié)構(gòu)的完整性，以至于影響其功能，因此通過(guò)抑制番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白（CP）基因核心序列tCP的表達(dá)，以阻止病毒在植物體內(nèi)繼續(xù)組裝、擴(kuò)繁，達(dá)到抗病的作用。

吳劍柄.2008.我國(guó)五種雙生病毒的分子鑒定及致病性研究〔博士論文〕.杭州：浙江大學(xué).

薩布魯克J，弗里克E F，曼尼阿蒂斯T.1999.分子克隆指南.北京：科學(xué)出版社.

Abel P P，Nelson R S，De B，Hoffmann N，Rogers S G，F(xiàn)rakey R T，Beachy R N.1986.Delay of disease development in transgenic plants that express theTobacco mosaic viruscoat protein gene.Science，232（4751）：738-743.

Cohen S，Antignus Y.1994.Tomato yellow leaf curl virus，a whitefly-borne geminivirus of tomatoes.Advances in disease vector research，10：259-288.

Cohen J，Gera A，Ecker R，Ben J R，Perlsman M，Gokkes M，Lachman O，Antlgnus Y.1995.Lisianthus leaf curl-a new disease of lisianthus caused byTomato yellow leaf curl virus.Plant Disease，79（4）：416-420.

Cohen S，Nitzany F E.1966.Transmission and host range of theTomato yellow leaf curl virus.Phytopathology，56（10）：1127-1131.

Czosnek H，Laterrot H.1997.A worldwide survey ofTomato yellow leaf curlviruses.Arch Virol，142（7）：1391-1406.

Gafni Y，Epel B L.2002.The role of host and viral proteins in intra-and inter-cellular trafficking of geminiviruses.Physiological and Molecular Plant Pathology，60（5）：231-241.

Gafni Y.2003.Tomato yellow leaf curl virus，the intracellular dynamics of a plant DNA virus.Molecular plant pathology，4（1）：9-15.

Ji Y H，Cai Z D，Zhou X W，Liu Y M，Xiong R Y.2012.First report ofTomato yellow leaf curl virusin common bean in China.Plant Disease，96（8）：1229-1230.

Kheyr-Pour A，Bendahmane M，Matzeit V，Accotto G P，Crespi S，Gronenborn B.1991.Tomato yellow leaf curl virusfrom sardinia is a whitefly-transmitted monoparatite geminivirus.Nucleic acids research，19（24）：6763-6769.

Moriones E，Navas-Castillo J.2000.Tomato yellow leaf curl virus，an emerging virus complex causing epidemics worldwide.Virus Res，71（1-2）：123-134.

Navas-Castillo J，Sánchez-Campos S，Antonio Diaz J，Moriones Enncue.1999.Tomato yellow leaf curlvirusiscauses a novel disease of common bean and severe epidemics in tomato in Spain.Plant Disease，83（1）：29-32.

Navot N，Pichersky E，Zeidan M，Zamir D，Czosnek H.1991.Tomato yellow leaf curl virus：a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.Virology，185（1）：151-161.

Noris E，Accotto G P，Tavazza R，Brunetti A，Crespi S，Tavazza M.1996.Resistance toTomato yellow leaf curl geminivirusinNicotiana benthamianaplants transformed with a truncated viral C1 Gene.Virology，224（1）：130-138.

Padidam M，Sawyer S，Clande M F.1999.Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination.Virology，265（2）：218-225.

Palukaitis P，Roossinck M J，Dietzgen R G，F(xiàn)rancki Richard L B.1992.Cucumber mosaic virus.Adv Virus Res，41（2）：281-341.

Regenmortel M H V，F(xiàn)auquet C M.2000.Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses.Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.Waltham：Academic Press.

Rizos H，Gunn L V，Pares R D，Gillings M R.1992.Differentiation ofCucumber mosaic virusisolates using the polymerase chain reaction.Journal of General Virology，73：2099-2103.

Sánchez-Campos S，Navas-Castillo J，Camero R，Soria C，Diaz A，Moriones E.1999.Displacement ofTomato yellow leaf curl virus（TYLCV）-Sr by TYLCV-Is in tomato epidemics in Spain.Phytopathology，89（11）：1038-1043.

Sánchez-Campos S，Navas-Castillo J，Monci F，Diaz J A，Moricnes E.2000.Mercurialis ambigua andSolanum luteum：two newly discovered natural hosts ofTomato yellow leaf curl geminiviruses.European Journal of Plant Pathology，106（4）：391-394.

Yan Miaomiao，Wei Guangcheng，Pan Xiaohong，Ma Huailei，Li Weizhen.2008.A method suitable for extracting genomic DNA from animal and plant-modified CTAB method.Agricultural Science & Technology，9（2）：39-41.