林居純，覃春紅，賴 婧，舒 剛，吳聰明

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

氨基糖苷類藥物是臨床上使用最為古老藥物之一，隨著藥物廣泛使用，細(xì)菌對(duì)該類藥物耐藥性日趨嚴(yán)重［1－2］。以往研究顯示，細(xì)菌產(chǎn)生修飾酶是導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生主要機(jī)制［3］。氨基糖苷類修飾酶按功能可分成乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、磷轉(zhuǎn)移酶（APH）、核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）。而AAC（6，）是自然界中重要的氨基糖苷類修飾酶，AAC（6′）-Ib是其中最常見的，賦予細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類耐藥。近年來，aac（6，）-Ib突變體aac（6′）-Ib-cr成為了研究熱點(diǎn)。aac（6′）-Ib-cr基因編碼讓氨基糖苷類和喹諾酮類兩種不同藥物發(fā)生乙?；揎椀男揎椕?。aac（6′）-Ib-cr基因的發(fā)現(xiàn)改變了之前認(rèn)為細(xì)菌不產(chǎn)生破壞喹諾酮類結(jié)構(gòu)酶觀點(diǎn)，為細(xì)菌耐喹諾酮類藥物分子機(jī)制研究開辟了新途徑。盡管aac（6′）-Ib-cr介導(dǎo)低水平喹諾酮類耐藥，但可增加染色體選擇性突變頻率。如果環(huán)境中存在有利于耐藥性誘導(dǎo)和耐藥基因傳播條件，勢(shì)必加重該耐藥基因迅速傳播和流行［4－5］。為了解食品動(dòng)物源沙門菌中aac（6′）-Ib-cr基因流行狀況，本次研究對(duì)316株食品動(dòng)物源沙門菌進(jìn)行了該基因檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 316株沙門菌自2003年至2010年間，從四川、河南、江蘇、廣東、江西省不同養(yǎng)殖場(chǎng)采集臨床樣本中分離得到。所有菌株經(jīng)生化、血清型鑒定為沙門菌，其中雞白痢沙門菌186株，菲利斯河沙門菌25株，吉韋沙門菌25株，科森沙門菌1株，腸炎沙門菌1株，沙拉姆沙門菌1株，卡杜納沙門菌1株，默爾斯沙門菌1株，布雷得尼沙門菌1株，伊魯根沙門菌1株，鴨沙門菌1株，布倫登盧普沙門菌3株，粗糙型沙門菌69株。質(zhì)控菌雞白痢沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（10398），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌ATCC25922，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 沙門菌aac（6′）-Ib-cr的 PCR 檢測(cè) 采用水煮沸法提取細(xì)菌DNA。aac（6′）-Ib基因引物參考文 獻(xiàn) 設(shè) 計(jì)［5］，aac（6′）-Ib-F：5′-TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA-3′，aac（6′）-Ib-R：5′-CTCGAATGCCTGGCGTGTTT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；反應(yīng)體系：模板DNA 2（μL），上、下游引物10（μmol／L）各1（μL），10×TaqBuffer（Mg＋plus）5（μL），d NTP Mixture（各2.5 mmol／L）4（μL），Ta KaRa公司 ExTaq（5 U／μL）0.5（μL），滅菌超純水加至50（μL）；PCR循環(huán)參數(shù)：（95℃，5 min）＋｛（94℃，30 s）＋（55℃，30 s）＋（72℃，45 s）｝×32＋（72℃，10min）。用Bst-CI酶對(duì)aac（6′）-Ib陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化試驗(yàn)，丟失酶切位點(diǎn)基因?yàn)閍ac（6′）-Ib-cr變異體［5］。隨機(jī)挑選陽性菌株的靶基因PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 藥物敏感性檢測(cè) 用微量肉湯稀釋法測(cè)定aac（6′）-Ib-cr陽性菌和陰性菌對(duì)鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMI）、萘啶酸（NAL）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、洛美沙星（LOM）10種藥物的敏感性，根據(jù)CLSI要求進(jìn)行藥物敏感性判斷［6］，雞白痢沙門菌（10398）和大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌。采用SAS 9.0軟件包的FREQ 過程進(jìn)行aac（6′）-Ib-cr陽性菌和陰性菌耐藥率顯著性檢驗(yàn)。

1.4aac（6′）-Ib-cr陽性菌 PFGE 分子分型 PFGE分型按照美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）推薦分型方案進(jìn)行［7］。

2 結(jié)果

2.1aac（6′）-Ib-cr基因 檢 測(cè) 316株 沙 門 菌 經(jīng)aac（6′）-IbPCR 擴(kuò)增和 BstCI酶切，結(jié)果有50株（15.82%）出現(xiàn)陽性。這50株陽性菌均為2007年～2010年間分離自四川省不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)。不同食品動(dòng)物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因檢出率可見，豬源、牛源菌株極顯著高于雞源、鴨源菌株（表1）。隨機(jī)挑選5株陽性菌aac（6′）-Ib-crPCR 測(cè)序后，與GenBank序列號(hào)FJ594765序列比對(duì)，同源性均為98%。

表1 不同食品動(dòng)物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因檢出情況

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 50株aac（6′）-Ib-cr陽性菌和266株陰性菌對(duì)鏈霉素等10種不同抗菌藥物耐藥率見表2。由表2可見，aac（6′）-Ib-cr陽性菌對(duì)鏈霉素等4種氨基糖苷類耐藥率顯著或極顯著高于陰性菌組（P＜0.05或P＜0.01），但對(duì)喹諾酮類除奈啶酸顯著高于陰性菌組外（P＜0.05），對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星耐藥率顯著或極顯著低于陰性菌組（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 aac（6′）-Ib-cr陰性菌和陽性菌株對(duì)不同藥物耐藥率比較 （%）

2.3 PFGE分型結(jié)果 50株陽性菌PFGE譜型為3類，其中25株吉韋沙門菌（S.Give）和菲利斯河沙門菌（S.Fyris）表現(xiàn)為兩種PFGE譜型，1株雷得尼沙門菌（S.Bredeney）呈不同譜型。

3 討論與結(jié)論

aac（6′）-Ib-cr編碼的乙?；?，是世界上首次發(fā)現(xiàn)能同時(shí)導(dǎo)致氨基糖苷類和喹諾酮類兩種藥物失活的雙功能酶，而且還能提高暴露于環(huán)丙沙星菌株發(fā)生染色體突變幾率［5］。自2003年在中國上海第一次發(fā)現(xiàn)該基因后，其他國家和地區(qū)也相繼出現(xiàn)aac（6′）-Ib-cr介導(dǎo)的耐藥性［4］。本次研究在316株食品動(dòng)物源沙門菌中檢測(cè)到了50株菌（檢出率15.82%）攜帶aac（6′）-Ib-cr基因，這些陽性菌株均分離自四川省不同養(yǎng)殖場(chǎng)。本次檢出率遠(yuǎn)高于其他國家檢出率［8－10］，這說明了在四川省食品動(dòng)物源沙門菌中aac（6′）-Ib-cr分布較廣。不同食品動(dòng)物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因檢出率比較可見，牛和豬體內(nèi)分離菌該基因檢出率遠(yuǎn)高于禽源菌株，這可能是由于牛、豬生活周期長(zhǎng)，用藥量大和時(shí)間長(zhǎng)，故對(duì)耐藥基因誘導(dǎo)和選擇性比生活周期短的禽類強(qiáng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)aac（6′）-Ib-cr陽性菌對(duì)4種氨基糖苷類藥耐藥率顯著或極顯著高于陰性菌，但奇怪的是對(duì)諾氟沙星、洛美沙星耐藥率與陰性菌無差異性，對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星和氧氟沙星均低于陰性菌。以上現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能是由于aac（6′）-Ib-cr酶對(duì)氨基糖苷類和氟喹諾酮類的乙酰化作用不同所致。已有研究證明aac（6′）-Ib-cr酶對(duì)氨基糖苷類親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于氟喹諾酮類，對(duì)氨基糖苷類乙?；饔脧?qiáng)于氟喹諾酮類，aac（6′）-Ib-cr基因只介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類低水平耐藥［11］，此外，可能是aac（6′）-Ib-cr陰性菌中存在其他介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥基因，而本次只檢測(cè)了aac（6′）-Ib-c基因，故菌株是否攜帶aac（6′）-Ib-cr基因，對(duì)氟喹諾酮類的耐藥性影響不及對(duì)氨基糖苷類。

PFGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本次檢測(cè)的50株aac（6′）-Ib-cr陽性菌只有3種譜型。同一血清型、但不同分離時(shí)間和不同食品動(dòng)物源的沙門菌具有相同PFGE譜型，表明這些菌株在進(jìn)化上可能是具有同源性較高的沙門菌克隆演變而成，同時(shí)也表明在不同時(shí)間、空間和動(dòng)物間存在交叉感染。相同或不同PFGE譜型菌株均檢出aac（6′）-Ib-cr，說明在本次分離的沙門菌中aac（6′）-Ib-cr基因在菌株間存在垂直傳播和水平傳播。

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