王 利，茍小蘭

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 動物遺傳育種學(xué)國家民委－教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersiniaenterocolitica）屬于耶爾森菌屬，腸桿菌科。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌廣泛存在于自然界中，是人、畜、魚等共患的致病菌，可引發(fā)人和動物患胃腸炎和腹瀉，還可引起關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑，嚴(yán)重時可引起敗血癥，造成死亡。從20世紀(jì)80年代開始，研究者用體外法測定小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力以代替昂貴的動物試驗。體外法主要包括：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的自凝性、血清抵抗性和毒力質(zhì)粒的測定等［1－2］。至今為止，對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展［3－4］。對其致病機制有了初步的認(rèn)識，但仍有許多的問題有待深入研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）已經(jīng)用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因，迅速對該菌進(jìn)行毒力鑒定，甚至在毒力質(zhì)粒丟失后仍然可以預(yù)測該菌的致病力［5］。本試驗采用PCR方法檢測和分析了魚源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5種重要的毒力基因：毒力活化因子基因（vir F）、粘附素基因（yad A）、粘附侵襲位點基因（ail）、毒力島基因（HPI-int）和耐熱腸毒素基因（ystB）。這有利于為深入探討魚源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力和致病性積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離自四川某胭脂魚養(yǎng)殖場，以甘油菌的形式保存于本實驗室－80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑 改良Y培養(yǎng)基和CIN-1培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自TIANGEN BIOTECH（BEIJING）；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（2000）等，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 參考文獻(xiàn)［6］，設(shè)計小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5對毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI－int）的引物，詳細(xì)見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 5對毒力基因引物序列

1.3.2 DNA模板制備 采用兩種方法制備小腸結(jié)腸炎耶爾森菌DNA模板。第一方法是煮沸法，主要步驟是：取營養(yǎng)平板上生長的單個菌落加入含50μL dd H2O的1.5 m L離心管中，混勻后放入－80℃冰箱中過夜，取出后立即放入沸水中煮10 min，12 000 r／min離心5 min，取上清液作為模板，－20℃凍存?zhèn)溆谩５诙N方法是用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)的體系：dd H2O 8.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物（濃度均為10μmol／L）各1μL，模板DNA 2 μL，共25μL。ail和HPI-int毒力基因PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃60 s，50℃60 s，72℃60 s，35個循環(huán)，72℃10 min。virF毒力基因PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃60 s，48℃60 s，72℃60 s，35個循環(huán)，72℃10 min。另外，兩種毒力基因（ystB和yad A）則采用梯度PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化：94℃5 min；94℃60 s，退火溫度分別為45℃、50℃、55℃和60℃，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5μL，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，80V電壓，電泳30 min，凝膠成像儀下拍照。

1.3.4 HPI-int基因測序和序列分析 HPI-int基因PCR反應(yīng)采用50μL體系：dd H2O 17μL，2×TaqPCR Master Mix 25μL，上游引物和下游引物（濃度均為10μmol／L）各2μL，模板DNA 4μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃60 s，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測出單一條帶后，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，采用ABI3730測序儀進(jìn)行正反向測序。所得序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，并采用生物信息學(xué)軟件DNAStar和Blastn等對該序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因檢測 分別用兩種方法制備的DNA作為模板，用PCR方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5種毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI-int），得到的結(jié)果相似，無明顯差異。ail基因目的條帶大小約為351 bp，HPI-int基因條帶大小約為714 bp，而virF基因目的條帶大小約為561 bp，這3種基因所得的PCR擴增產(chǎn)物大小與試驗預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果詳見圖1。另外兩種基因（ystB和yad A）在反復(fù)優(yōu)化PCR條件后都未擴增出目的條帶，表明該菌株未攜帶ystB和yad A這兩種毒力基因。

圖1 毒力基因的擴增1：ail；2：HPI-int；3：yad A；4：vir F；5：ystB；M：DNA Marker分子量

2.2 HPI-int基因序列分析 HPI-int基因分別使用正反向引物測序，采用DNAStar軟件中的Seqman對正反向序列進(jìn)行組裝、拼接，最終所得序列長度為722 bp，將該序列提交到 NCBI，GenBank序列號為JX041513。采用NCBI的Blastn工具對該序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該序列與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌強毒力島基因（Yersiniaenterocoliticaleft arm of the highpathogenicity island Score，GenBank 序 列 號 為AJ132668.1）序列的相似性為99% （705／710），因此表明HPI-int基因的測序結(jié)果和預(yù)期相符合。

3 討論

耶爾森菌的致病因素主要包括：毒力質(zhì)粒編碼的分泌系統(tǒng)、外膜蛋白、侵襲性與毒素、鐵攝取系統(tǒng)和超抗原等方面［7］。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病因素主要是該菌所具有的特殊染色體基因、毒力質(zhì)粒和菌毛。ail、HPI-int、yst A、ystB和 HPI毒力基因位于染色體上，而yad A和virF毒力基因位于質(zhì)粒上。致病性的耶爾森菌可分為低致病性和高致病性兩類。這種分類與染色體上是否攜帶有 HPI毒力島有關(guān)，因為HPI是高毒力細(xì)菌表型表達(dá)的必需條件。這個染色體上的片段涉及生物合成、調(diào)節(jié)和耶爾森菌含鐵鐵載體的轉(zhuǎn)運作用。在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中，毒力島只出現(xiàn)于高致病性的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物1B型 ，而低致病性的則無［4］。

至今為止，對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因已經(jīng)進(jìn)行了一些研究［8－9］。典型的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶ail、yst A、yad A基因和virF毒力基因。致病性菌株不攜帶ystB，而非致病性菌株不攜帶ail、yst A、yad A、vir F。ystB主要為生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶的編碼一種性質(zhì)類似于yst A的耐熱性腸毒素。ystB僅存在于生物1A型的菌株，而且在這個生物型中，目前資料表明這類菌株通常都是非致病性菌株。81株生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均未檢測出ail、virF、yst A基因和ystC基因［10］。王鑫等（2005）運用PCR和DNA探針雜交方法檢測了致病性和非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶的ystB基因［11］。48株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均不攜帶該基因。98株非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中有52株攜帶ystB基因，占53.06%。這表明ystB基因僅存在于部分生物1A型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，而不存在于致病性菌株中。以上多個研究結(jié)果基本一致。本試驗通過多次優(yōu)化PCR條件也未檢測出ystB基因，這提示該菌株很可能為致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

裴耀文等（2011）發(fā)現(xiàn)3株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株的毒力基因檢測中均表現(xiàn)為ail和yst A陽性，而yad A、virF毒力基因缺失［12］。吉林省致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型毒力基因的分布情況表明，血清型O：3和O：9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因的分布主要為ail＋、yst A＋、ystB－、yad A＋、virF＋型，其次是ail＋、yst A＋、ystB－、yad A－、vir F－型［13］。南京地區(qū)不同來源的123株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病生物型菌株，均包含染色體上的毒力基因ail［14］。因此，ail與致病生物型之間存在明顯關(guān)聯(lián)。Zheng等（2008）用PCR方法檢測了從腹瀉病人糞便中分離出160株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因。檢出率分別 為：ail（94%）、inv（100%）、yst A （93%）、ystB（7.5%）、ystC（5%）、yad A（89%）和virF（82%）［5］。該結(jié)果表明，并非所有的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌都攜帶了能引起疾病的染色體和質(zhì)粒上的全部毒力基因。由此推測，其中一些缺乏某種毒力基因的菌株可能具有其他的、未知的毒力標(biāo)記，從而在致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的多種發(fā)病機理中發(fā)揮著重要的作用。以上報道的結(jié)果存在一些較小的差異，可能是由于不同地區(qū)、不同菌株的差異或毒力基因的檢測片段的差異等原因。

本試驗中檢測出了ail、vir F和HPI-int，而未檢測到y(tǒng)ad A，這與以上報道基本相一致。這也提示該菌具有致病性。HPI-int基因的測序結(jié)果分析表明，該序列與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌強毒力島基因的相似性達(dá)到99%，從而驗證了本試驗HPI-int基因檢測的正確性，也進(jìn)一步說明該菌株具有較強的致病性。yad A基因未被檢出到可能是由于該基因位于質(zhì)粒上，在實驗室分離培養(yǎng)過程中菌株多次傳代及長時間平板上保存后都很容易丟失質(zhì)粒。質(zhì)粒上的毒力基因與致病生物型之間的關(guān)聯(lián)性要略低一些，因此依賴于質(zhì)粒毒力基因檢測通常是存在較大誤差。致病性耶爾森菌遺傳背景復(fù)雜，染色體DNA指紋分析具有多態(tài)性。在檢測細(xì)菌毒力基因時必須檢測染色體上的毒力因子，不能僅用毒力質(zhì)粒的檢測。選擇染色體上的毒力基因時可優(yōu)先選擇ail基因，同時實驗室應(yīng)避免質(zhì)粒丟失而使有毒株被誤判為無毒株。綜上所述，本試驗運用PCR方法檢測了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株的5種毒力基因。本菌株檢測并分析了染色體上的毒力島（HPI-int）基因，因此推測它是強毒力株，具有較強的致病性。下一步，將進(jìn)行本菌株對多種魚類的致病性試驗，深入研究該菌株的毒性及其危害。

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