韓克強(qiáng)，李 靖，梁 平，鄭 璐，黃小兵 (第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝膽外科，重慶400037)

在中醫(yī)臨床中，龜板對(duì)促進(jìn)肝臟再生、修復(fù)均有明顯的治療效果，同時(shí)在多種治療肝病的中藥方劑中龜板也均是重要的組成部分。但龜板對(duì)肝損傷后的抗纖維化和肝功能修復(fù)是否有益處，目前尚不清楚。既往研究提示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在損傷肝臟結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)中均發(fā)揮重要作用，參與肝臟損傷后的抗纖維化和解毒功能修復(fù)等過程［1］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，龜板飼養(yǎng)可促進(jìn)MSCs向肝臟定植。因此，本研究擬通過CCl4肝損傷模型研究龜板飼養(yǎng)對(duì)大鼠肝臟功能修復(fù)和抗纖維化的作用，旨在為肝損傷修復(fù)的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、標(biāo)記及移植

按文獻(xiàn)［2］方法培養(yǎng)原代MSCs。頸椎脫臼法處死大鼠，取股骨，PBS 吹吸骨髓，DMEM-L 培養(yǎng)基稀釋。2 500 r/min 密度梯度離心后收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS 洗滌去除分離液后接種于24孔板內(nèi)。培養(yǎng)條件:DMEM-L(含 10% FBS)培養(yǎng)基，在 5%CO2，37 ℃飽和濕度。細(xì)胞貼壁生長，待90%融合時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化，DMEM-L 重懸，按1 ×104cm-3傳代培養(yǎng)，收集第3 ～4 代 MSCs 備用。腺病毒(攜帶綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染MSCs，擴(kuò)增培養(yǎng)后消化、收集，PBS 重懸后制成單細(xì)胞懸液，取MSCs 懸液1 mL(含細(xì)胞數(shù)約1 ×106)，經(jīng)大鼠尾靜脈注射移植，移植 MSCs 均每2 d 注射1 次。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備及分組

6 ～8 周齡雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量 200 ～250 g(均購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。選擇常見的CCl4肝損傷動(dòng)物模型為細(xì)胞移植受體。2%CCl4按照2.5 mL/kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組相同劑量的生理鹽水灌胃。肝損傷模型建立后，根據(jù)是否服用龜板水煎液分為龜板組和普食組，2 組均常規(guī)飼養(yǎng)，龜板組每天給予龜板口服液4 mL，分上午和下午2 次灌胃1 周;普食組則給予等體積蒸餾水灌胃。其中龜板口服液采用水煎法制備。制備含龜板生藥量1 kg/L 的水煎液，根據(jù)成人日服藥量10 倍折算成大鼠灌胃劑量，合4 g/kg，灌前稀釋成4 mL。

1.3 Western blot 檢測(cè) HGF 蛋白

組織總蛋白提取:脫頸處死動(dòng)物，取各組肝臟組織100 mg。加入1 mL 冰預(yù)冷的蛋白提取液和10 μl PMSF，然后在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。將樣品轉(zhuǎn)入1.5 mL 4 ℃的 EP 管中，20 000 × g 離心15 min，收集上清。取其中少量測(cè)蛋白濃度(BCA 法)，其余分裝凍存。取等量預(yù)處理的蛋白樣品上樣，恒壓60 V 對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉-PBST 室溫封閉1 h 后，加入羊抗大鼠 HGF 抗體(1∶1 000)、羊抗大鼠 GAPDH(1∶1 000)、4 ℃孵育過夜，再與 HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 37 ℃孵育1 h，按ECL 發(fā)光試劑盒說明書操作，凝膠成像儀(美國 Bio-Rad 公司)曝光、照相。目的蛋白量以GAPDH 相對(duì)量表示。

1.4 激光共聚焦檢測(cè)肝臟MSCs 含量

取肝臟組織，做冰凍切片，4%多聚甲醛固定后PBS 洗滌3次，封片。移植MSCs 中均轉(zhuǎn)染表達(dá)GFP 的腺病毒，因此，激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞即為移植MSCs。計(jì)數(shù)方法:每張切片隨機(jī)選10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)各個(gè)視野MSCs 個(gè)數(shù)后取平均值。

1.5 肝臟纖維化及功能指標(biāo)檢測(cè)

取肝臟組織，10%福爾馬林溶液固定過夜，石蠟包埋后按5 μm厚連續(xù)切片。切片脫蠟至水，取0.1 g 天狼星紅(美國santa 公司)溶于100 mL 苦味酸飽和液中，苦味酸天狼星紅染液浸染1 h，PBS 沖洗，蘇木素染核。封片后在偏振光顯微鏡下隨機(jī)觀察10 個(gè)視野，以Photoshop 軟件的Histogram 功能分析各組織內(nèi)Ⅰ型膠原所占面積的百分?jǐn)?shù)。肝組織Hyp 是由膠原和彈性蛋白水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14% ，其他蛋白質(zhì)中罕見，Hyp 含量隨著肝纖維化加重而增多。采用胃酶酸解法檢測(cè)肝組織Hyp［3］，根據(jù)測(cè)得的A560 和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克肝組織的Hyp 的含量。腹主動(dòng)脈取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述定量資料。2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，3 組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 龜板對(duì)肝損傷大鼠肝臟修復(fù)的影響

大鼠肝損傷模型建立后，分別觀察普食及龜板飼養(yǎng)0 d、7 d、14 d 及 28 d 的肝臟 I 型膠原面積百分比、Hyp 含量，及血清白蛋白、ALT 水平(圖1)。肝損傷模型建立后(0 d)，2 組肝臟Ⅰ型膠原面積百分比、Hyp含量，及血清白蛋白、ALT水平均無

圖1 2 組CCl4 肝損傷后肝纖維化及修復(fù)相關(guān)指標(biāo)比較(n=6)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。14 d 及28 d 時(shí)，與普食組相比，龜板組肝臟Ⅰ型膠原面積百分比、Hyp 含量及ALT 水平明顯降低，血清白蛋白水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 龜板對(duì)肝損傷大鼠肝臟HGF 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)正常及CCl4損傷大鼠肝臟組織HGF 蛋白。正常組普食喂養(yǎng)(0.35 ±0.03)，正常組龜板喂養(yǎng)(0.58 ±0.04)，損傷組普食喂養(yǎng)(0.62 ±0.04)，損傷組龜板喂養(yǎng)(0.76±0.03)，與正常組相比，無論普食或龜板喂養(yǎng)，肝損傷大鼠肝臟HGF 蛋白表達(dá)明顯增加;與普食喂養(yǎng)組相比，無論正常或肝損傷大鼠，龜板喂養(yǎng)明顯增高肝臟HGF 蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 龜板對(duì)移植MSCs 向肝損傷大鼠肝臟定植的影響

激光共聚焦法檢測(cè)定植于肝臟組織MSCs 數(shù)量。每個(gè)視野下 MSCs 平均數(shù):正常組普食喂養(yǎng)(14.22 ± 1.85)，正常組龜板喂養(yǎng)(21.45 ±1.94)，損傷組普食喂養(yǎng)(18.68 ±2.34)，損傷組龜板喂養(yǎng)(27.06 ±1.45)。與正常組相比，無論普食或龜板喂養(yǎng)，肝損傷后移植MSCs 肝臟定植增加;與普食喂養(yǎng)組相比，無論正常或肝損傷大鼠，龜板喂養(yǎng)明顯增高移植MSCs 的肝臟定植，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

通過對(duì)大鼠CCl4肝損傷模型的研究，我們發(fā)現(xiàn)龜板飼養(yǎng)可以明顯減少肝纖維化程度相關(guān)指標(biāo)，如I 型膠原面積百分比、Hyp 含量，并可降低肝功能損傷指標(biāo)ALT 水平，同時(shí)增加肝臟活性指標(biāo)血清白蛋白水平，為中藥龜板促進(jìn)急性肝損傷的修復(fù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)龜板可促進(jìn)移植MSCs 向肝臟歸巢。因此，本研究中是以MSCs 移植做為背景研究龜板對(duì)損傷肝的修復(fù)作用。那么，龜板促損傷肝修復(fù)的作用是否與MSCs 有關(guān)呢?近來的研究發(fā)現(xiàn)，給予龜板口服液后能促進(jìn)循環(huán)中MSCs 向受損的脊髓組織歸巢，并在其內(nèi)增殖，從而減輕神經(jīng)損傷和病理改變，并增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖［4-5］。同時(shí)，龜板也可以增強(qiáng)移植MSCs 歸巢后向神經(jīng)元細(xì)胞分化。對(duì)腦缺血的大鼠進(jìn)行MSCs 移植治療時(shí)，給予龜板口服液和對(duì)照組大鼠相比，可明顯增強(qiáng)移植MSCs 在缺血腦紋狀體內(nèi)的歸巢和增殖［6］。這些發(fā)現(xiàn)均證實(shí)，龜板可通過影響干細(xì)胞的增殖分化從而參與器官的損傷和修復(fù)。但是否對(duì)肝臟組織中的MSCs 也有類似作用，目前尚無直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)肝損傷后HGF 表達(dá)明顯增加，而龜板飼養(yǎng)可進(jìn)一步促進(jìn)CCl4肝損傷大鼠肝臟的HGF 表達(dá)。一般認(rèn)為，損傷局部的微環(huán)境和干細(xì)胞之間的相互作用促使干細(xì)胞向損傷部位定向優(yōu)勢(shì)分布。近來研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長因子能介導(dǎo)干細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分布。HGF 是一種間質(zhì)源性生長因子，最初是從大鼠血漿和血小板中分離得到，是一種分泌型肝素親和糖蛋白，具有重要的抗纖維化作用［7］。其配體c-met，已經(jīng)證實(shí)MSCs 表達(dá)c-met。在本研究中，可以觀察到肝損傷后 HGF 水平明顯增高，這與 Kanemura 等［8］的研究相符，在肝臟發(fā)生損傷后，肝臟間質(zhì)細(xì)胞分泌肝細(xì)胞生長因子并激活原癌基因c-met 的表達(dá)，因此血清HGF/c-met 水平高于正常水平，而我們的結(jié)論是基于肝組織HGF 水平測(cè)定所得，有更直接的證據(jù)意義。Kucia 等［9］在對(duì)缺血性腦損傷小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，HGF 可誘導(dǎo)MSCs 向損傷的神經(jīng)組織歸巢并促進(jìn)神經(jīng)組織的再生，但用抗c-met 抗體預(yù)處理MSCs 后，即封閉HGF 的受體后，MSCs 向損傷神經(jīng)組織的歸巢明顯減少。該研究提示HGF/c-met 軸在介導(dǎo)MSCs 向損傷組織歸巢中發(fā)揮重要作用。同樣，Trapp 等［10］也發(fā)現(xiàn)HGF/c-met 軸能介導(dǎo)MSCs 向損傷組織的優(yōu)勢(shì)歸巢。因此，我們推測(cè)MSCs 在HGF/c-met 軸介導(dǎo)下，能夠優(yōu)勢(shì)歸巢于肝臟損傷部位，也就是說，如果損傷部位的肝組織HGF 含量增加，可以促進(jìn)MSCs 進(jìn)入肝臟損傷部位。我們發(fā)現(xiàn)龜板飼養(yǎng)可進(jìn)一步增加損傷肝臟的HGF 水平，同時(shí)促進(jìn)移植的MSCs 向肝臟定植，這與上述理論推測(cè)相符，也為龜板促肝臟損傷修復(fù)的機(jī)制研究提供了新的線索。

綜上所述，我們的研究提示龜板治療可能通過HGF/c-met 軸上調(diào)MSCs 優(yōu)勢(shì)分布于肝臟組織，從而促進(jìn)損傷肝修復(fù)。但上述可能機(jī)制只是相關(guān)性研究，還需要基因功能表達(dá)或抑制的研究進(jìn)一步明確HGF/c-met 軸是否在上述過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

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