溫 雪，付博銳，王彥杰，高亞梅，劉 權(quán)，晏 磊，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

木質(zhì)纖維素大部分存在于作物秸稈、園林廢棄物和畜禽糞便等各種有機(jī)固體廢棄物中，這些有機(jī)廢棄物大部分被隨意廢棄，導(dǎo)致嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1-2]。因此，將這些有機(jī)廢棄資源循環(huán)利用，如生產(chǎn)乙醇、甲烷或其他生物質(zhì)基礎(chǔ)材料[3]，對于緩解世界資源短缺、治理環(huán)境污染意義重大。

近年來，研究利用自然條件下微生物之間的協(xié)同關(guān)系，富集獲得穩(wěn)定高效分解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系，均表現(xiàn)出強(qiáng)大的纖維素分解能力。崔宗均等篩選獲得復(fù)合菌系MC1，在3 d內(nèi)，對濾紙和麥稈的分解率分別為94%和38%[4]。Igarashi等構(gòu)建的復(fù)合菌系在培養(yǎng)4 d后，濾紙的失重率為79%，可降解60%的稻稈[5]；王偉東等構(gòu)建的復(fù)合菌系WSC-6，培養(yǎng)3 d內(nèi)，濾紙和稻稈的分解率可達(dá)到97%和82.2%[6-7]；劉長莉經(jīng)馴化篩選出復(fù)合菌系NSC-7，培養(yǎng)5 d，降解稻稈總干重的44.7%[8]。高效分解纖維素復(fù)合菌系的成功構(gòu)建，為加速天然木質(zhì)纖維素資源的利用研究開辟了新路。

Bell等研究表明菌株之間的協(xié)同作用和群落組成在決定系統(tǒng)功能上發(fā)揮重要作用[9]。在自然條件下，纖維素分解是在眾多微生物的協(xié)同作用下完成，而利用天然原料富集獲得的復(fù)合菌系中微生物組成尚不明確，因此要研究復(fù)合菌系組成成份之間協(xié)同分解纖維素的機(jī)理，必須獲得純培養(yǎng)菌株。已有研究表明，目前能分離培養(yǎng)的微生物不到世界微生物總量的1%，一些分解木質(zhì)纖維素的菌株是甚至不可培養(yǎng)微生物，必須改良現(xiàn)有方法或者發(fā)明新的分離方法才能得到這些難培養(yǎng)微生物。Madden等采用纖維素濾紙球磨處理72 h，然后將球磨漿滾管的方法分離1株高溫厭氧可降解纖維素的梭菌屬Clostridium[10]；Leschine等利用雙層平板法分離獲得嗜熱厭氧纖維素降解細(xì)菌Clostridium thermocellum可在高溫厭氧條件下直接轉(zhuǎn)化纖維素為乙醇[11]；Kato等利用Hungate技術(shù)從復(fù)合菌系中分離獲得1株具有分解纖維素能力的新梭桿菌，被命名為Clostridium straminisolvens sp.nov.，其生長條件不是嚴(yán)格厭氧，在氧濃度高至4%時還能分解纖維素[12]。本實(shí)驗室富集1組具有高效穩(wěn)定分解纖維素能力的復(fù)合菌系WSC-9，能夠在50℃靜止培養(yǎng)條件下7 d分解80%以上的水稻秸稈。本研究為了分離復(fù)合菌系中的純培養(yǎng)菌株，明確復(fù)合菌系的微生物組成，為研究復(fù)合菌系分解纖維素的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，獲得新的能夠分解和轉(zhuǎn)化纖維素的微生物資源，為木質(zhì)纖維素資源的生物利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗用復(fù)合菌系

本試驗用復(fù)合菌系WSC-9為從高溫期堆肥原料中富集獲得，復(fù)合菌系培養(yǎng)采用PCS培養(yǎng)基（NaCl 5.0 g，CaCO32.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母粉1.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，1.0%水稻秸稈和1.0%濾紙(Advantec quantitative filter paper no.5A)條為碳源，1.0×105Pa滅菌30 min。

1.2 復(fù)合菌系中厭氧細(xì)菌純培養(yǎng)的分離

1.2.1 相關(guān)溶液配制

生長培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基：KCl 0.2 g，K2HPO33.5 g，KH2PO31.5 g，NaCl 1.0 g，NH4Cl 1.0 g，MgCl20.5 g，酵母粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，半胱氨酸0.5 g，微量元素5.0 mL[12]，維生素1.0 mL[13]，刃天青1 mL，固體為加入瓊脂20.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中。除半胱氨酸、微量元素、維生素、刃天青（0.1%）以外的藥品于電磁爐上煮開，依次加入微量元素、維生素、半胱氨酸、刃天青，煮數(shù)分鐘至培養(yǎng)基顏色淺黃色，在吹氮?dú)獾那闆r下，將培養(yǎng)基分裝至自制的Hungate氏厭氧瓶中，瓶中提前放入相應(yīng)的碳源（濾紙1%V/W、水稻秸稈、纖維二糖Sigma0.5%V/W等），1.0×105Pa滅菌30 min待用。

PBS中加入1%L-鹽酸半胱氨酸（V/W）[12]，厭氧細(xì)菌緩沖液，用于稀釋厭氧菌液。

1.2.2 分離過程及方法

首先將復(fù)合菌系接入分離培養(yǎng)基（以濾紙為碳源）中，待濾紙完全降解，取出菌液利用PBS進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度(稀釋倍數(shù)為10-6)菌液涂平板，將涂好的平板置于厭氧培養(yǎng)罐中（英國Oxoid AnaeroJar 2.5 L）培養(yǎng)5～8 d。待平板上長出菌落，將菌落挑出于Hungate厭氧管（培養(yǎng)基為液體，纖維二糖為碳源）中培養(yǎng)，等待濾紙降解。將可使濾紙降解的厭氧管中的菌液取出接入Hungate厭氧管（培養(yǎng)基為固體，纖維二糖為碳源）中，經(jīng)多次滾管得到具有降解能力的單菌落。

1.3 菌株的形態(tài)觀察

將1.2中獲得的菌株進(jìn)行以下試驗：菌株的革蘭氏染色；利用掃描電鏡（型號：FEI QUANTA 200）觀察菌體的形態(tài)、大小等。

1.4 細(xì)菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'）和 1 492R（5'GGT TACCTTGTTACGACTT 3'），擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因片段。PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應(yīng)體系為50 μL體系：10×buffer 5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，primer 27F（50 μmol·L-1）0.5 μL，primer1492R（50 μmol·L-1）0.5 μL，模板DNA 1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94℃變性5 min；94℃1 min；55℃1 min；72℃2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。以保證PCR產(chǎn)物的穩(wěn)定，將產(chǎn)物純化后送交測序公司測序。

將菌株的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，選擇覆蓋率和相似率較高的序列，運(yùn)用Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧純培養(yǎng)菌株的獲得

生長穩(wěn)定期的WSC-9對于纖維素降解率最高，此時培養(yǎng)液的pH處于7.0左右。利用1.2.2的分離方法，在自行設(shè)計的Hungate厭氧裝置中經(jīng)過6代的分離培養(yǎng)，獲得了1株具有纖維素分解能力的純培養(yǎng)菌株，命名為WSC-9-7（見圖1、2）。

圖1 Hungate厭氧管中培養(yǎng)的菌株WSC-9-7Fig.1 Degradation of filter paper inoculated with anaerobic bacterial WSC-9-7 using Hungate screw-capped test tubes(160mm×10mm)

圖2 菌株WSC-9-7降解濾紙、稻稈Fig.2 Degradation of filter paper and rice straw inoculated with anaerobic bacterial isolation WSC-9-7

2.2 厭氧菌株純培養(yǎng)及纖維素降解能力的測定

在50℃靜置培養(yǎng)條件下，復(fù)合菌系WSC-9在培養(yǎng)到第3天時，濾紙（培養(yǎng)基1.0%含量，重量比）可以降解95%以上，培養(yǎng)到第5天時稻稈（培養(yǎng)基1.0%含量，重量比）可降解80%以上，而純培養(yǎng)菌株WSC-9-7在第10天時可以降解47.0%的稻稈。表1是復(fù)合系WSC-9和菌株WSC-9-7在50℃下培養(yǎng)10 d后稻稈中木質(zhì)纖維素的降解情況。就纖維素的分解能力來看，菌株WSC-9-7對于木質(zhì)纖維素的降解能力要小于復(fù)合菌系WSC-9。WSC-9-7在降解濾紙及稻稈時可將培養(yǎng)液的pH降至5.4左右，最低至5.0，這與復(fù)合菌系WSC-9在降解木質(zhì)纖維素時的趨勢不同（見圖3）。

表1 WSC-9和WSC-9-7對稻稈中木質(zhì)纖維素降解率Table 1 Degradation ratio of lignocellulose of rice straw by WSC-9 and WSC-9-7(%)

圖3 WSC-9和WSC-9-7在培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基pH的變化Fig.3 Medium pH of WSC-9 and WSC-9-7 during the cultivation process

2.3 WSC-9-7形態(tài)特征

將WSC-9-7在分離培養(yǎng)基的瓊脂平板上培養(yǎng)5 d，形成的菌落為邊緣不光滑的圓形菌落，白色不透明。為革蘭氏陽性。挑取分離培養(yǎng)基上的菌株，對菌體進(jìn)行適當(dāng)處理，在掃描電鏡下觀察菌體的形態(tài)及大小。菌體形態(tài)的掃描電鏡圖片,菌株為短桿狀，產(chǎn)孢子（見圖4）。

2.4 菌株WSC-9-7的16S rRNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序得到菌株WSC-9-7的16S rDNA基因序列，含有1 407 bp，GenBank登錄號JQ 404436。將菌株WSC-9-7的16S rDNA基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與Clostridium屬具有較高相似性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明與FN563295親緣關(guān)系密切，序列相似性達(dá)到99%，通過查找相關(guān)文獻(xiàn)，F(xiàn)N563295為未培養(yǎng)的微生物（見圖5）。

圖4 菌株WSC-9-7的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.4 SEM photo of WSC-9-7

圖5 厭氧菌株WSC-9-7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree derived from partial 16S rDNA sequence

表2 與WSC-9遺傳相似率相近的菌株信息Table 2 Information of close phylogenetic bacteria with WSC-9(%)

3 討論與結(jié)論

a.WSC-9是1組以高溫期牛糞堆肥為原料富集獲得的具有高效穩(wěn)定分解纖維素能力的細(xì)菌復(fù)合群體，本試驗以復(fù)合菌系WSC-9為基礎(chǔ)試驗對象，為了研究其微生物組成，明確復(fù)合菌系間的微生物協(xié)同作用，分離獲得復(fù)合菌系中的可有效降解纖維度的純培養(yǎng)菌株。將Hungate厭氧操作技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，分離獲得厭氧細(xì)菌WSC-9-7，可穩(wěn)定高效降解纖維素。WSC-9-7在50℃下靜止培養(yǎng)10 d，稻稈的總干重減少47%，纖維素減少57%，半纖維素減少31%，木質(zhì)素減少12%。在以纖維二糖為碳源的分離培養(yǎng)基上，菌落為圓形，邊緣不光滑，白色不透明，革蘭氏染色陽性，能夠利用纖維二糖、纖維素、濾紙、稻稈。經(jīng)序列對比，與FJ907163和FN563295的相似性均達(dá)到99%，僅僅從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上判斷，WSC-9-7屬于Clostridium屬。

b.自然界有很多可以分解纖維素的細(xì)菌，尤其是可以產(chǎn)生纖維小體[14]的厭氧細(xì)菌，對于纖維素的分解效率很高。經(jīng)報道，這些厭氧細(xì)菌多分布于Clostridium屬，而目前的手段和技術(shù)方法不能夠完全分離這些厭氧生物。已經(jīng)報道具有纖維素分解能力的細(xì)菌有Clostridium Thermocellum、C.Sterecorarium、 C.Thermopapyrolyticum、 C.Acetobutylicum、C.Cellulovorans、C.Cellulosi、C.Cellulolyticum、 C.Herbivorans、 Ruminococcus flavefaciens、Methanobacterium、Methanosarcina、Thermoanaerobium等[6]。從中，可以看出大部分為梭菌屬、瘤胃球菌屬和一些產(chǎn)乙醇的菌屬。從系統(tǒng)進(jìn)化樹上，主要有三種：梭菌屬、產(chǎn)乙醇的菌屬和一些未獲得純培養(yǎng)的菌屬。梭菌屬的細(xì)菌多數(shù)為革蘭氏染色陽性桿菌，能形成芽孢，厭氧條件下生長，部分嗜高溫。細(xì)菌WSC-9-7的16S rDNA基因序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)WSC-9-7與登錄號為FN563295的未培養(yǎng)菌株編號1相似率高達(dá)99%，用甜菜青貯和糞便進(jìn)行中溫厭氧發(fā)酵時，改變水力停留時間、有機(jī)負(fù)荷率、底物三個參數(shù)，分析發(fā)酵體系中微生物菌群的變化。在克隆結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Clostridium屬一直存在于發(fā)酵中，編號1菌株就是其中一個。系統(tǒng)發(fā)育樹上其它兩株未培養(yǎng)的菌株均是在發(fā)酵中被檢測到，它們分別是表中編號4、5的細(xì)菌，與WSC-9-7的相似率分別為93%、95%。將1、4、5均歸為Clostridium屬。WSC-9-7與編號2和3菌株的相似率較1號菌株次之，分別為99%和98%，均屬于Clostridium屬，但相關(guān)介紹尚未公開發(fā)表，無法獲得具體數(shù)據(jù)。只有來源可供參考：2號菌株從中國大港油田的地下巖層中獲得，3號菌株獲得于冰島的熱泉中，均嗜高溫厭氧條件下生長。6號細(xì)菌的具體數(shù)據(jù)也尚未公開發(fā)表，只知其來源于濕地，厭氧條件下生長。7號菌株是Rees等[15]在厭氧發(fā)酵中獲得一株Clostridium屬的專性厭氧細(xì)菌，可降解纖維素產(chǎn)乙醇、乙酸等。8號菌株是Collins等[16]和Stackebrandt[17]分別提到其屬于Clostridium屬中的第IV簇，可以降解纖維素類物質(zhì)。9號菌株是Nanqi Ren等通過Hungate技術(shù)分離獲得，其可在22～44℃下利用木質(zhì)纖維素、葡萄糖等產(chǎn)乙醇、乙酸、氫氣、二氧化碳等[18]。Kato等從纖維素降解復(fù)合系CSK1中分離獲得1株梭桿菌即10號菌株，它在50～55℃下可以分解纖維素，被命名為Clostridium stramini-solvens sp.nov.，在氧濃度高至4%時還能分解纖維素，所以認(rèn)為其生長條件不嚴(yán)格厭氧[12]。

通過系統(tǒng)發(fā)育樹，WCS-9-7與1、2、3的相似率最高為99%、99%、98%，就理化性質(zhì)而言，它們還是有差別的：1是28～35℃的中溫發(fā)酵中存在，WCS-9-7與2、3均嗜高溫50～60℃。相似率在95%以下的菌株，7、8、9、10均可利用纖維素類物質(zhì)產(chǎn)乙醇、乙酸等物質(zhì)，這與WCS-9-7的理化性質(zhì)相近。綜述以上，初步判定WSC-9-7可能屬于Clostridium屬中的一個新種。但是其確切的分類地位還有待用DNA分子雜交的技術(shù)手段配以菌種生理生化性質(zhì)鑒定作進(jìn)一步鑒定。

c.WCS-9-7對纖維素的降解效果明顯低于復(fù)合系WSC-9，推測在復(fù)合系中厭氧菌負(fù)責(zé)降解纖維素，好氧細(xì)菌為厭氧菌維持生長環(huán)境，并可能利用纖維素分解菌的產(chǎn)物解除反饋抑制，好氧菌的存在可以幫助厭氧細(xì)菌更完全地降解纖維素。另外，復(fù)合菌系降解木質(zhì)纖維素時可以保持發(fā)酵體系的pH處于偏堿性，而純菌株則是5.0，本試驗為研究復(fù)合菌系分解纖維素的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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