王 爽，王玉峰

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，黑龍江省土壤環(huán)境與植物營養(yǎng)重點實驗室，哈爾濱 150086）

極端微生物或嗜極微生物（Extremophile）作為地球上的一種邊緣生命現(xiàn)象，具有獨特的基因類型、特殊的生理機制及多樣化的代謝產(chǎn)物，不僅在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、輕化工、環(huán)境和能源等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景，而且在生命起源、系統(tǒng)進化和環(huán)境適應(yīng)等方面具有重要啟示作用[1]。

嗜鹽微生物（Halophilie）是極端微生物的重要類群之一，由于具有特殊的細胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等特征而受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[2]。根據(jù)對鹽濃度的需求和耐受程度不同，可將嗜鹽微生物分為輕度嗜鹽菌（Slight halophile）、中度嗜鹽菌（Moderate halophile）和 極 端 嗜 鹽 菌（Extreme halophile），遍布于細菌、古菌和真核生物三個域中，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等各領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[3]。鹽土環(huán)境中的主要細菌類群為鹽單胞菌科（Halomonadaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），對高鹽土壤中植物生長有間接的促進作用[2,4]，其耐鹽相關(guān)基因可考慮用作構(gòu)建耐鹽微生物和植物資源，對鹽堿地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有潛在價值。

嗜堿菌（Alkaliphiles）最適生長在pH 8.0以上，通常為pH 9～10的一類微生物。分為兼性嗜堿菌（Facultative alkaliphiles）和專性嗜堿菌（obligate alkaliphiles）[5-6]。不同類型的嗜堿菌已從土壤、堿湖、堿性泉甚至海洋中分離得到[7]，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中多種酶制劑的生產(chǎn)。嗜鹽嗜堿菌主要分布于高鹽高堿環(huán)境中，如從Magadi湖分離到的液泡嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium vacuolata）和格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi），從我國西藏堿湖中分離到的特臘帕尼鹽桿菌（Halobacterium trapanicum）和亞洲嗜鹽堿桿菌（Natrialba asiatica）等[8]。

大慶市位于黑龍江省西部、松嫩平原中部，地處我國八大土地鹽漬化區(qū)中的東北半濕潤-半干旱草原-草甸鹽漬區(qū)，獨特的地理氣候特征和多樣的鹽漬土類型賦予該地區(qū)豐富的嗜鹽微生物資源。本課題組在對大慶鹽堿土嗜鹽菌多樣性研究過程中發(fā)現(xiàn)一系列可培養(yǎng)的中度嗜鹽菌[9]。本研究對其中一株中度嗜鹽菌菌株20-13進行初步分類鑒定，報道了采用純培養(yǎng)法和基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法對嗜鹽菌株20-13的研究結(jié)果，旨在為20-13的后續(xù)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與菌株的分離、純化

土壤樣品于2007年4月采自大慶蘇打鹽堿土，取0～15cm深度的土壤，土樣過2 mm孔徑篩后進行梯度稀釋，涂布在含20%NaCl（W/V）的改良S-G平板上[10]，置于37℃溫箱培養(yǎng)兩周，反復(fù)劃線直至獲得純菌落。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

分離到的單菌落劃線接種于含10%NaCl（W/V）的改良S-G固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色、大小、邊緣和表面隆起等特征。革蘭氏染色采用Dussault的方法[11]。BX5-1普通光學(xué)顯微鏡（Olympus）觀察細胞形態(tài)。

2.3 生理生化特征

參考Meta等方法[12]和《常用細菌鑒定手冊》[13]，測定項目包括生長所需NaCl濃度、pH、溫度的范圍及最適值，發(fā)酵糖產(chǎn)酸，氧化酶、過氧化氫酶活性，硝酸鹽還原，淀粉、明膠、酪素水解，產(chǎn)H2S試驗等。

2.4 16S rRNA基因序列分析

采用CTAB法抽提細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，采用16S rRNA通用引物進行PCR擴增菌株20-13的16S rRNA基因[14]。純化PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli Top10高效感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送交北京華大基因科技有限公司測序。測得的16S rRNA序列通過BLAST軟件中的“nucleotide blast”與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，得出試驗菌株與相關(guān)菌株之間的16S rRNA序列相似性。再用ClustalW2軟件包進行多序列匹配排列（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/）。采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。刪除序列匹配排列中的插入和缺失，根據(jù)“Kimura雙參數(shù)”方式，通過序列數(shù)據(jù)計算進化距離。選擇鄰近連接法（Neighbour-joining）對系統(tǒng)進化樹進行估算，通過1 000次取樣確定其Bootstrap值。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果

分離株20-13形成圓形、邊緣完整、表面微凸起、不透明的乳白色光滑菌落，在含20%NaCl（W/V）的改良S-G平板上菌落直徑為0.6～1.2 mm（圖1a）。細胞為革蘭氏陰性的桿狀，大小為0.3～0.5×3～5 μm，借助于周生鞭毛運動（見圖1b），膨大的芽孢位于頂端（見圖1c）。

圖1 菌株20-13的形態(tài)照片F(xiàn)ig.1 Morphological picture of strain 20-13

3.2 生長和生理生化特征鑒定結(jié)果

菌株20-13生長NaCl范圍1%～25%（W/V），最適為3%（W/V）；生長pH范圍8.0～11.0，最適pH 10.0；生長溫度范圍20～50℃，最適為30～32℃；氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性；不能水解Tween 20、 Tween 40、Tween 60 和 Tween 80；可產(chǎn)生H2S；不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；可水解明膠、酪素和淀粉；不能由葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖和松三糖產(chǎn)酸。菌株20-13與堿桿菌屬（Alkalibacillus）模式菌株的差異見表1。

表1 菌株20-13與堿桿菌屬（Alkalibacillus）其他種的模式菌株特征比較Table 1 Characteristics of strain 20-13 and the type strains of other Alkalibacillus species

3.3 16S rRNA序列分析

利用PCR擴增獲得1 563 bp大小的16S rRNA基因序列，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫的注冊號為JQ926742。與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列的比對結(jié)果表明，菌株20-13與堿桿菌屬（Alkalibacillus）同源性最高，分別為A.filiformis 99.4%、A.haloalkaliphilus 99.3%、A.silvisoli 98.6%、A.flavidus 96.6%、A.salilacus 96.4%、A.halophilus 96.2%。采用鄰近連接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

圖2 用鄰近連接法構(gòu)建的菌株20-13與其它相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences from strain 20-13 and other related type strains.

4 討論與結(jié)論

堿桿菌屬（Alkalibacillus）包括6個有效種（http://www.bacterio.cict.fr/），分 別 為 A.filiformis、 A.flavidus、 A.haloalkaliphilus、 A.halophilus、 A.salilacus和 A.silvisoli，其中 A.haloalkaliphilus是芽孢 桿 菌 屬（Bacillus）的一 新 種（B.haloalkaliphilus），后來經(jīng)再分類并入堿桿菌屬，并定義為該屬的典型種[20]。

根據(jù)16S rRNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)進化樹可判斷微生物物種之間親緣關(guān)系的遠近，如果16S rRNA序列同源性低于98%，認為屬于不同的種；同源性為93%～95%，認為屬于不同的屬[21]。通過對菌株20-13生長特性的研究可知，該菌株為嗜堿的中度嗜鹽細菌，在所測定的形態(tài)學(xué)特征、生理學(xué)特征、生化和酶學(xué)特征及營養(yǎng)要求等方面，菌株20-13與堿桿菌屬（Alkalibacillus）的A.filiformis基本一致，基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化分析也進一步證明菌株20-13與堿桿菌屬的A.filiformis序列相似性最高（99.4%），因此兩者應(yīng)為同一個種。

利用純培養(yǎng)方法分離獲得的菌株20-13經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株20-13為堿桿菌屬（Alkalibacillus）的成員，在種的水平上最終確定為Alkalibacillus haloalkaliphilus。

[1]李俊,沈德龍,林先貴.農(nóng)業(yè)微生物研究與產(chǎn)業(yè)化進展[M].北京：科學(xué)出版社,2011:135-153.

[2]Oren A.Diversity of halophilic microorganisms:Environments,phylogeny,physiology,and applications[J].J and Microbiol Biotechnol,2002,28:56-63.

[3]Margesin,R.,Schinner,F.Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology[J].Extremophiles,2001(5):73-83.

[4]Ventosa A,Nieto J J,Oren A.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62:504-544.

[5]Krulwich T A,Guffanti A A,Bornstein B F,et al.A sodium requirement for growth,solute transport,and pH homeostasis in Bacillus firmus RAB[J].J Biol Chem,1982,257(4):1885-1889.

[6]Krulwich T A,Guffanti A A.Alkalophilic bacteria[J].Annu Rev Microbiol,1989,43:435-463.

[7]華洋林,趙繼倫,潘力.嗜堿菌的特性及其應(yīng)用前景[J].生命的化學(xué),2004,24(4):358-360.

[8]陳俊,連賓,王斌,等.極端環(huán)境下的微生物及其生物地球化學(xué)作用[J].地學(xué)前緣,2006,13(6):199-207.

[9]王爽,楊謙,孫磊,等.鹽堿土中可培養(yǎng)中度嗜鹽菌的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(8):37-42.

[10]田新玉,徐毅,劉洪燦,等.嗜鹽嗜堿桿菌屬的一個新種[J].微生物學(xué)報,1997,37(1):1-6.

[11]Dussault H P.An improved technique for staining red halophilic bacteria[J].J Bacteriol,1955,70:484-485.

[12]Mata J A,Martínez-Cánovas,Quesada E,et al.A detailed phenotypic characterization of the type strains of Halomonas species[J].Systematic and Applied Microbiology,2002,25:360-375.

[13]東秀珠,蔡妙芬.常用細菌鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[14]Reysenbach A L,Longnecker K,Kirshtein J.Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a mid-atlantic ridge hydrothermal Vent[J].Appl Environ Microbiol,2000,66:3798-3806.

[15]Tamura K,Dudley J,Nei M,et al.MEGA 4:Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Mol Biol Evol,2007,24:1596-1599.

[16]Romano I,Lama L,Nicolaus B,et al.Alkalibacillus filiformis sp.nov.,isolated from a mineral pool in Campania,Italy[J].Int J Syst Evol Microbiol,2005,55:2395-2399.

[17]Usami R,Echigo A,Fukushima T,et al.Alkalibacillus silvisoli sp.nov,an alkaliphilic moderate halophile isolated from non-saline forest soil in Japan[J].Int J Syst Evol Microbiol,2007,57:770-774.

[18]Fritze D.Bacillus haloalkaliphilus sp.nov[J].Int J Syst Bacteriol,1996,46:98-101.

[19]Yoon J H,Kang S J,Jung Y T,et al.Alkalibacillus flavidus sp.nov.,isolated from a marine solar saltern[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60:434-438.

[20]Jeon C O,Lim J M,Lee J M,et al.Reclassification of Bacillus haloalkaliphilus Fritze 1996 as Alkalibacillus haloalkaliphilus gen.nov.,comb.nov.and the description of Alkalibacillus salilacus sp.nov.,a novel halophilic bacterium isolated from a salt lake in China[J].Int J Syst Evol Microbiol,2005,55:1891-1896.

[21]溫洪宇,韓寶平,周玉樓,等.嗜鹽菌HBCC-3的培養(yǎng)特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(14):5804-5806.