李健業(yè),吳海容,李海先,侯樹剛,孫瑛,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

·論著·

ALOX5AP、COX2和MMP9基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性

李健業(yè),吳海容,李海先,侯樹剛,孫瑛,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

目的探討5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)、環(huán)氧化酶2(COX2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)基因單個位點(diǎn)、單倍型及基因-基因間的相互作用與缺血性腦卒中(IS)的相關(guān)性。方法檢測302例IS病人及308例健康查體者(對照組)ALOX5AP89G/A、COX2-765G/C、COX2-1195G/A以及MMP9-1562C/T的基因多態(tài)性,并對各基因位點(diǎn)及COX2基因兩個位點(diǎn)的單倍型進(jìn)行分析。用廣義多因子降維(GMDR)方法檢測基因與基因之間的相互作用。結(jié)果COX2-765GC基因型和COX2-1195GA基因型均與IS的患病風(fēng)險相關(guān)(校正后OR＝2.650、1.565),COX2-765C等位基因和COX2-1195G等位基因增加IS患病風(fēng)險(OR＝2.142、1.344);IS組單倍型C-765A-1195和G-765G-1195較對照組高(OR＝1.872、1.289),而單倍型G-765A-1195較對照組低(OR＝0.649);IS組和對照組ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T位點(diǎn)等位基因、基因型的頻率差異均無顯著性(P＞0.05)。GMDR檢測顯示,COX2基因和MMP9基因間相互作用有統(tǒng)計學(xué)意義,但多元Logistic回歸沒有進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用。結(jié)論漢族人群IS可能與COX2基因多態(tài)性有關(guān),ALOX5AP基因和MMP9基因多態(tài)性與IS可能無關(guān);IS病人COX2基因和MMP9基因間可能沒有相互作用。

5-脂氧合酶激活蛋白;環(huán)氧化酶2;明膠酶B;腦血管意外;遺傳;多態(tài)性,單核苷酸

腦卒中是我國人口疾病死亡的主要原因之一,由動脈粥樣硬化導(dǎo)致的缺血性腦卒中(IS)是其最常見的類型。炎癥是動脈粥樣硬化的一個關(guān)鍵性致病機(jī)制,通過促進(jìn)粥樣斑塊的形成、不穩(wěn)定斑塊的發(fā)展及斑塊破裂,最終導(dǎo)致腦卒中[1]。該過程涉及多個危險因子,血漿基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)/5-脂氧合酶(5-LO)通路的產(chǎn)物白三烯B4、環(huán)氧化酶2(COX-2)/前列腺素E2(PGE2)通路的產(chǎn)物PGE2在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。研究結(jié)果表明,MMP9基因、ALOX5AP基因及COX2基因參與、影響不同的炎癥通路[2-3],其基因變異造成大量MMP9、白三烯B4及PGE2的產(chǎn)生,參與局部炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化形成及斑塊破裂等病理過程,增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險。IS是一種與遺傳因素密切相關(guān)的多基因疾病。單基因?qū)δX卒中患病風(fēng)險的影響可能很小甚至檢測不到,但是多種微效基因的相互作用可能會成為患病的主要誘因。基于以上機(jī)制,本研究將COX2、ALOX5AP和MMP9基因作為候選基因,探討其單個位點(diǎn)、單倍型以及基因-基因間的相互作用與IS的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2011—2012年,選取在我科住院的IS病人302例,符合第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)顱腦CT或MRI/MRA及頸部血管彩超確診,并由兩名神經(jīng)科醫(yī)師根據(jù)臨床及各項檢查結(jié)果進(jìn)行TOAST分型(主要為大動脈粥樣硬化型和小動脈閉塞型)。排除腦出血、蛛網(wǎng)膜下隙出血、心源性腦栓塞、顱內(nèi)腫瘤和腦血管畸形所致腦梗死,以及重癥全身性疾病如膠原病、內(nèi)分泌代謝性疾病(糖尿病除外)、嚴(yán)重的心肝腎功能損害等病人。選取同期我院健康查體者308例作為對照組,經(jīng)詳細(xì)詢問病史及體格檢查,均無腦血管病史。所有受試者為漢族人群,均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 問卷調(diào)查、體格檢查和實(shí)驗室檢查 由專業(yè)醫(yī)務(wù)人員,對受檢者進(jìn)行心腦血管病問卷調(diào)查,身高、體質(zhì)量及血壓測定。采集受檢者空腹12 h的外周靜脈血,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平。

1.2.2 基因型判定 采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性方法,檢測ALOX5AP89G/A、COX2-765G/C、COX2-1195G/A以及MMP9-1562C/T的基因多態(tài)性。根據(jù)各位點(diǎn)的已知序列及參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計引物并選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。DNA引物由上海生工生物工程有限公司合成;限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。PCR反應(yīng)體系10μL,內(nèi)含: DNA模板1.0μL,Taq Master Mix 5.0μL,上下游引物各0.2μL,緩沖液3.6μL。酶切反應(yīng)體系為10μL,內(nèi)含有:PCR產(chǎn)物3.0μL,限制性內(nèi)切酶0.3μL,緩沖液1.0μL,滅菌雙蒸水5.7μL。酶切產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察酶切結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計量資料結(jié)果用±s表示,數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗;計數(shù)資料比較采用卡方檢驗[5]。多基因相互作用的統(tǒng)計分析采用廣義多因子降維(GMDR)軟件,連鎖不平衡狀態(tài)的分析應(yīng)用Haploview軟件,單倍型構(gòu)建應(yīng)用SHEsis軟件。多元Logistic回歸調(diào)整腦梗死傳統(tǒng)危險因素的影響。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

IS組和對照組的年齡、性別、TG、TC、HDL、LDL、吸煙史、高血壓史、糖尿病史差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝2.253～9.587,χ2＝27.638～119.484,P＜0.05),體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 各基因型及等位基因分布與關(guān)聯(lián)分析

IS組和對照組中各位點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。多元Logistic回歸分析顯示,校正年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險因素以后,COX2-765GC基因型的人群IS患病風(fēng)險是COX2-765GG基因型的2.650倍(校正后的OR＝2.650,95%CI＝1.434～4.895,P＜0.01),而COX2-1195GA基因型的人群其IS患病風(fēng)險是COX2-1195AA基因型的1.565倍(校正后OR＝1.565,95%CI＝1.010～2.425,P＜0.05);COX2-765C等位基因的人群IS患病風(fēng)險是COX2-765G等位基因的2.142倍(OR＝2.142,95%CI＝1.330～3.449,P＜0.01),COX2-1195G等位基因的人群IS患病風(fēng)險是COX2-1195A等位基因的1.344倍(OR＝1.344,95%CI＝1.071～1.686,P＜0.01);IS組和對照組ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率比較,差異均無顯著性(P＞0.05)。見表2。

2.3 連鎖不平衡和單倍型分析

應(yīng)用Haploview軟件分析顯示,COX-2基因兩多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖不平衡(D’＝1,r2＝0.075)。應(yīng)用SHEsis軟件構(gòu)建單倍型,見表3。IS組單倍型G-765G-1195及C-765A-1195均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝4.803、6.572,OR＝1.289、1.872,95% CI＝1.027～3.044,P＜0.05);而單倍型G-765A-1195則低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝14.151, OR＝0.649,95%CI＝0.518～0.813,P＜0.01)。

2.4 基因-基因相互作用的分析

將ALOX5AP基因、COX2基因和MMP9基因各位點(diǎn)的基因型納入GMDR模型,各等級最佳相互作用模型見表4。包含ABD的三階最佳模型對IS有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.010 7,CV＝10)。為進(jìn)一步解釋GMDR最佳模型的統(tǒng)計學(xué)意義,用多元Logistic回歸分析該模型,以分類變量IS組和對照組為因變量,以COX2基因型、MMP9基因型為自變量進(jìn)行分析,采用進(jìn)入法進(jìn)行回歸分析。經(jīng)校正年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙等因素后,COX2基因型與MMP9基因型間的相互作用無統(tǒng)計學(xué)意義(OR＝0.827,95%CI＝0.544～1.258,P＞0.05)。

表1 IS組與對照組一般資料比較(±s)

組別n年齡(歲)____男性(χ/%)__ BMI (kg/m2)_ TG(c/ mmol·L－1) TC(c/ mmol·L－1) HDL(c/ mmol·L－1) LDL(c/ mmol·L－1)吸煙史(χ/%)_高血壓史(χ/%)__糖尿病史(χ/%)對照組308 63.21±8.19 45.3 23.64±2.92 1.56±0.93 4.95±0.91 1.42±0.35 2.59±0.75 23.4 26.3 16.2 IS_組_302 65.71±9.88__54.7__24.07±2.79_1.74±0.95__4.67±1.15__1.27±0.32__2.74±0.81 46.7 70.5 34.8

3 討 論

目前認(rèn)為,復(fù)雜疾病的影響因素分為兩類:一是異質(zhì)性相關(guān)因子,二是相互作用相關(guān)因子[6]。前者包括位點(diǎn)異質(zhì)性、等位基因異質(zhì)性等;后者包括基因-基因相互作用和基因-環(huán)境相互作用。這些影響因素中的一個或者多個,無論是簡單的疊加,還是網(wǎng)絡(luò)性的相互作用,均造成復(fù)雜疾病的復(fù)雜性。屬于復(fù)雜疾病的腦卒中受到的遺傳因素的影響亦是多基因模式的。

COX2是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的主要限速酶,COX2及前列腺素可導(dǎo)致血管壁的炎癥反應(yīng)、斑塊的不穩(wěn)定及內(nèi)膜增生。COX2基因編碼COX2,后者可以誘導(dǎo)PGE2高表達(dá),進(jìn)而觸發(fā)動脈粥樣硬化內(nèi)膜中PGE2依賴的MMP9的表達(dá),促進(jìn)粥樣斑塊進(jìn)入不穩(wěn)定狀態(tài)。本文研究結(jié)果顯示, COX2-765GC基因型、COX2-1195-GA基因型以及COX2-765C等位基因和COX2-1195G等位基因是IS的危險因素,單倍型C-765A-1195和G-765G-1195亦是IS的危險因素,而G-765A-1195單倍型則是IS的保護(hù)因素。這與之前的一些研究結(jié)果相似[7-8],提示COX2基因與IS具有相關(guān)性。

ALOX5AP/5-LO通路是白三烯代謝的重要中間環(huán)節(jié)。ALOX5AP可與花生四烯酸結(jié)合后激活5-LO,進(jìn)一步調(diào)節(jié)白三烯的產(chǎn)生,而白三烯是典型的促炎因子,可激活白細(xì)胞、增加血管通透性以及啟動和加速動脈粥樣硬化病理過程等[9]。研究表明, ALOX5AP基因的單倍型Hap A可使冰島人群的腦卒中風(fēng)險增加1.67倍[10],該基因變異可造成大量白三烯的產(chǎn)生和炎癥遞質(zhì)的分泌,參與血管炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[3]。MMP9屬于明膠酶,主要通過降解Ⅳ、Ⅴ型膠原,破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,造成血管損傷,同時降解纖維帽內(nèi)膠原纖維致纖維帽變薄,易于形成不穩(wěn)定斑塊。已有研究證實(shí),MMP9-1562C/T基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性疾病相關(guān),該位點(diǎn)C向T的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性增加,參與了動脈粥樣硬化的細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥細(xì)胞浸潤、斑塊破裂等病理過程[2]。然而本研究并未顯示ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T基因多態(tài)性與IS相關(guān)。

腦卒中是一種多基因參與、多危險因素的復(fù)雜疾病,單個易感基因?qū)Ρ硇偷挠绊戄^小(OR＝1.2～1.5)[11],多個不同的基因參與影響不同的通路,最終導(dǎo)致腦卒中發(fā)生。一項對中國人群的研究結(jié)果顯示,Notch3、MTHFR和ALOX5AP基因的相互作用可以顯著增加血栓性腦卒中的患病風(fēng)險(OR＝3.72)[12]。本文研究采用GMDR方法檢測到COX2基因和MMP9基因間存在相互作用,但這種相互作用應(yīng)用多元Logistic回歸研究未得到證實(shí),故我們認(rèn)為IS病人COX2基因和MMP9基因可能無相互作用。

本研究也存在著一些不足之處:①樣本量較小,也許不具有人群代表性,統(tǒng)計學(xué)效能的不足可能導(dǎo)致陰性結(jié)果,因此需要在更大樣本量的病例對照人群中進(jìn)一步研究;②只檢測了候選基因上的一個或兩個位點(diǎn),這些位點(diǎn)可能無法覆蓋整個基因的連鎖不平衡信號,因此有必要構(gòu)建各基因的連鎖不平衡圖,以明確各基因與IS發(fā)病的關(guān)系;③由于遺傳的異質(zhì)性和表型的異質(zhì)性,不同地區(qū)和不同種族人群對同一疾病的易感性不同,因此還需要在不同地區(qū)、不同種族人群中進(jìn)行驗證。

總之,本研究表明COX2基因的兩個多態(tài)位點(diǎn)及其構(gòu)建的單倍型均與IS發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)性,目前尚不明確COX2基因和MMP9基因間相互作用與IS是否有關(guān)。該研究對于闡明IS的遺傳機(jī)制,探索IS患病風(fēng)險預(yù)測、開發(fā)藥物治療新靶點(diǎn)等方面具有一定參考價值。

[1]ROSS R.Atheroselerosis——an inflammatory disease[J].The New England Journal of Medicine,1999,340(2):115-126.

[2]BLANKENBERG S,RUPPRECHT H J,POIRIER O,et al.Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease[J].Circulation,2003,107(12):1579-1585.

[3]KAJIMOTO K,SHIOJI K,ISHIDA C,et al.Validation of the association between the gene encoding 5-lipoxygenase-activating protein and myocardial infarction in a Japanese population[J].Circulation Journal:Official Journal of the Japanese Circulation Society,2005,69(9):1029-1034.

[4]GAI X B,LAN X P,LUO Z R,et al.Association of MMP-9 gene polymorphisms with atrial fibrillation in hypertensive heart disease patients[J].Clinica Chimica Acta,2009,408(1/ 2):105-109.

[5]殷蓓蓓,梁軍,谷建.晚期結(jié)直腸癌GSTP1基因多態(tài)性與奧沙利鉑化療效果關(guān)系[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(3):192-194.

[6]THORNTON-WELLS T A,MOORE J H,HAINESJ L.Genetics,statistics and human disease:analytical retooling for complexity[J].Trends in Genetics:TIG,2004,20(12):640-647.

[7]COLAIZZO D,FOFI L,TISCIA G,et al.The COX-2 G/C-765 polymorphism may modulate the occurrence of cerebrovascular ischemia[J].Blood Coagulation&Fibrinolysis,2006,17 (2):93-96.

[8]MOONS L M,KUIPERS E J,RYGIEL A M,et al.COX-2 CA-haplotype is a risk factor for the development of esophageal adenocarcinoma[J].The American Journal of Gastroenterology,2007,102(11):2373-2379.

[9]孫蕾,李聰,宋博,等.ALOX5AP基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,48(3):207-210.

[10]HELGADOTTIR A,MANOLESCU A,THORLEIFSSON G,et al.The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke[J].Nature Genetics,2004,36(3):233-239.

[11]MANOLIO T A,COLLINS F S,COX N J,et al.Finding the missing heritability of complex diseases[J].Nature,2009,461 (7265):747-753.

[12]LIU J H,SUN K,BAI Y Y,et al.Association of three-gene interaction among MTHFR,ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke:a multicenter case-control study[J].Human Genetics,2009,125(5/6):649-656.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

ASSOCIATION BETWEEN GENE POLYMORPHISM OF ALOX5AP,COX2,MMP9 AND ISCHEMIC STROKE

LI Jianye,WU Hairong,LI Haixian,HOU Shugang,SUN Ying,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo explore whether genetic variants in the ALOX5AP gene,COX2 gene and MMP9 gene would synergistically influence the risk of ischemic stroke(IS).MethodsVariants of ALOX5AP89G/A,COX2-765G/C,COX2-1195G/A and MMP9-1562C/T in 302 IS patients and 308 healthy controls were detected,and the polymorphisms studied.By using GMDR,the interaction among genes was measured.ResultsCOX2-765GC genotype(adjusted OR＝2.650)and COX2-1195GA genotype(adjusted OR＝1.565)were associated with the risk of IS.In IS group,C-765A-1195and G-765G-1195were higher than that in the control(OR＝1.872,1.289),while G-765A-1195was lower(OR＝0.649);The differences of ALOX5AP89G/A and MMP9-1562C/T allele,and genotype frequency between ISand control group were not significant(P＞0.05).The GMDR analysis showed a statistically significant gene interaction between COX2 and MMP9,but which was not confirmed by Logistic regression analysis.ConclusionIn Han people,IS may associate with genetic polymorphism of COX2,and not with ALOX5AP and MMP9.There is probably no interaction of COX2 and MMP9 in IS.

ALOX5AP;cyclooxygenase 2;gelatinase B;cerebrovascular accident;heredity;polymorphism,single nucleotide

R743

A

1008-0341(2013)04-0321-04

10.11712/qlyx201304013

2012-12-03;

2013-03-07

山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2010HM061)

李健業(yè)(1985-),男,在讀碩士研究生。

張晨(1957-),男,教授,博士生導(dǎo)師。