王雅娟(綜述)，劉長庭(審校)

隨著人類對太空的涉足，有關(guān)空間生命科學(xué)的研究越來越深入。在人體表面、呼吸道和胃腸道均寄居著大量與人類健康息息相關(guān)的細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，在微重力條件下，一些條件致病菌的毒力和致病性增加[1]，可對宇航員的健康產(chǎn)生威脅。

目前，有關(guān)微重力環(huán)境下細(xì)菌致病性變化的研究越來越受到重視。由于受航天飛行時間、條件等因素所限，航天飛行器搭載實驗實施較困難，為了在地面模擬微重力環(huán)境，美國國家航空航天局(National Aeronautics and Space Administration，NASA)發(fā)明了生物反應(yīng)器(rotating wall vessel bioreactor，RWV)。RWV是一種垂直低速旋轉(zhuǎn)(10～60r/min)、充滿液體的圓柱形懸浮培養(yǎng)容器，在旋轉(zhuǎn)過程中重力向量呈隨機(jī)化分布，可模擬10－2g的微重力狀態(tài)[2]，而其水平旋轉(zhuǎn)時則是正常重力狀態(tài)?；谶@一原理，NASA又發(fā)明了高截面縱橫比容器(high aspect ratio vessel，HARV)。目前二者均已廣泛用于模擬微重力實驗[3-4]。本文綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)闡述微重力環(huán)境下細(xì)菌致病性的變化及其可能機(jī)制，為解決未來太空飛行及空間站上航天員的健康維護(hù)及抗感染治療提供新的思路和線索。

1 微重力對細(xì)菌毒力和致病性的影響

由于空間站上最大的微生物庫是宇航員的腸內(nèi)常駐菌群，有關(guān)微重力對細(xì)菌毒力和致病性影響的研究多集中在沙門菌和大腸埃希菌。在模擬微重力暴露下，沙門菌感染后第6天小鼠的生存率與對照組相比明顯降低，感染后第10天其生存率僅20%，而對照組為60%[5]。另一項研究利用尾吊法使小鼠處于微重力狀態(tài)，經(jīng)口灌注濃度為1×107cfu/ml模擬微重力暴露后的鼠傷寒沙門菌，灌注后第3天的死亡率由原來的60%上升至100%。該研究還發(fā)現(xiàn)，在模擬微重力暴露后大腸埃希菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞以及模擬微重力暴露后鼠傷寒沙門菌感染的小鼠上皮細(xì)胞中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌增加，ELISA法檢測顯示，大腸埃希菌感染巨噬細(xì)胞后感染4h，常重力對照組TNF-α濃度3.8ng/ml，而微重力實驗組為9.5ng/ml。進(jìn)一步將大腸埃希菌和巨噬細(xì)胞在模擬微重力條件下共培養(yǎng)4h，其上清液TNF-α的濃度高達(dá)35ng/ml。同樣，鼠傷寒沙門菌感染小鼠上皮細(xì)胞實驗中，模擬微重力組的TNF-α轉(zhuǎn)錄較正常對照組上升了12倍[6]。2006年，亞特蘭蒂斯號航天飛機(jī)空間實驗發(fā)現(xiàn)，與地面對照組比較，航天飛機(jī)搭載的沙門菌感染小鼠死亡時間提前，死亡率增高，半數(shù)致死劑量(LD50)降低，這一結(jié)論與既往地面模擬實驗一致[7]。Orihuela等[8]研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力暴露后肺炎鏈球菌對細(xì)胞的黏附能力增加，同時一種黏附蛋白及其相關(guān)轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)量也有升高。Aviles等[9]使用大鼠尾吊模型進(jìn)行模擬微重力研究，通過口腔灌注銅綠假單胞菌，發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境下大鼠對該致病菌的易感性增加，使用肺炎克雷白桿菌采用同樣的模擬微重力方式也獲得了相似結(jié)果。

為進(jìn)一步探討微重力致細(xì)菌毒力增強(qiáng)的機(jī)制，Chopra等[6]采用微陣列分析進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)模擬微重力處理后鼠傷寒沙門菌的22個基因發(fā)生了變化，其中上調(diào)的基因有9個，主要是環(huán)境壓力調(diào)節(jié)基因，而13個下調(diào)的基因包括多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)菌毒力基因。他們利用雙向凝膠電泳法發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒性大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌的蛋白表達(dá)譜均發(fā)生明顯變化，并應(yīng)用Northern blotting進(jìn)一步證實產(chǎn)毒性大腸埃希菌編碼毒力因子LT-1的基因發(fā)生了上調(diào)。Wilson等[10]在細(xì)菌mRNA水平的研究發(fā)現(xiàn)，與鼠傷寒沙門菌細(xì)菌毒力相關(guān)的基因(orgA、prgH、sipD、invI、invA、pigB、sseB、ssaL、ssaV、sseJ)在微重力環(huán)境干預(yù)后發(fā)生下調(diào)，上述基因編碼沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type three secretion systems/injectisomes，TTSSs)，TTSSs與許多革蘭陰性桿菌毒力因子的分泌有關(guān)，革蘭陰性桿菌通過這些毒力因子感染人類、動物、昆蟲和植物[11]。顯然，這些基因的下調(diào)與前述微重力致細(xì)菌毒力增加的結(jié)論相矛盾，但其中機(jī)制尚有待探明。此外針對革蘭陽性呼吸道細(xì)菌肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)錄的研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力刺激相關(guān)的基因主要呈下調(diào)反應(yīng)[12-13]，這與前述的革蘭陰性腸道細(xì)菌研究結(jié)果并不一致。由上述研究可見，微重力對細(xì)菌來說是一個獨(dú)立的刺激因子，可引起廣泛的基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白組變化，但其機(jī)制尚不明確。幸運(yùn)的是，在亞特蘭蒂斯號航天飛機(jī)STS-115空間實驗中，空間環(huán)境致沙門菌毒力增加的機(jī)制研究有所進(jìn)展，Wilson等[14]發(fā)現(xiàn)與地面對照組比較，STS-115攜帶的沙門菌有167種基因表達(dá)發(fā)生變化，其中69種表達(dá)增加，98種表達(dá)下調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)，調(diào)控蛋白Hfq在微重力所致細(xì)菌侵襲性增加及巨噬細(xì)胞存活能力提高中起著重要作用。Hfq是一種RNA結(jié)合蛋白，通過與sRNA和mRNA結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用[7]。此外，這項研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽可抵抗微重力所致的鼠傷寒沙門菌毒力增加，在STS-115搭載過程中，鼠傷寒沙門菌分別在LB肉湯培養(yǎng)基和M9普通培養(yǎng)基(含有較高濃度的無機(jī)鹽，其中無機(jī)磷酸鹽比LB培養(yǎng)基高61倍)生長。結(jié)果顯示，經(jīng)航天搭載后，M9普通培養(yǎng)基中生長的沙門菌毒力并未增加，小鼠的LD50較地面對照組并未降低。地面模擬微重力實驗提示，無機(jī)磷酸鹽與產(chǎn)生這一現(xiàn)象的關(guān)系較大[14]。Hfq的作用在銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO1的研究中也得到證實[15]。Crabbè等[16]的研究表明，PAO1經(jīng)航天搭載后，167個mRNA基因和28種蛋白發(fā)生變化，Hfq即是主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。該研究還發(fā)現(xiàn)PAO1毒力相關(guān)基因——凝集素基因lecA、lecB以及鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因rhlA均發(fā)生明顯上調(diào)，后者可促進(jìn)鼠李糖脂的生成。

2 微重力對細(xì)菌生物被膜形成的影響

細(xì)菌生物被膜(或稱細(xì)菌生物膜，bacterial biofilm，BF)是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，這些物質(zhì)將細(xì)菌包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[15]。多糖基質(zhì)除了多糖蛋白復(fù)合物，也包括周邊沉淀的有機(jī)物和無機(jī)物等。生物被膜的形成受RpoS基因編碼產(chǎn)物σS(RpoS蛋白)的調(diào)控[17-18]。σS是細(xì)菌RNA聚合酶的一個特別亞基，具有識別特定啟動子的能力，RpoS基因的激活可啟動一系列下游基因表達(dá)，使細(xì)菌適應(yīng)惡劣的生長環(huán)境，從而穩(wěn)定生長。生物被膜不僅可提高細(xì)菌對抗生素以及滲透壓、酸堿性、過氧化等環(huán)境刺激的抵抗，而且在病變組織表面形成生物被膜可造成慢性持續(xù)性感染，因其可不斷釋放游離菌，同時生物被膜的主要成分藻酸鹽可導(dǎo)致周圍組織的變態(tài)反應(yīng)，造成組織損傷[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，在航天飛船上，細(xì)菌可生成更厚更穩(wěn)定的生物被膜[20]。Lynch等[21]通過大腸埃希菌的模擬微重力實驗證實了這一變化。為進(jìn)一步研究其機(jī)制，研究人員敲除了大腸埃希菌的RpoS基因，發(fā)現(xiàn)該突變株在模擬微重力條件下生物被膜形成下降。因細(xì)菌生物被膜與細(xì)菌對環(huán)境的抵抗以及耐藥性有關(guān)，該研究也發(fā)現(xiàn)模擬微重力暴露后的大腸埃希菌對氯霉素、青霉素、鹽以及乙醇的抵抗力均有所增加。在模擬微重力條件下其RpoS缺失突變株對乙醇、鹽的抵抗力也相應(yīng)下降，但對抗生素的抵抗力卻沒有變化，這一結(jié)果提示模擬微重力對細(xì)菌生物被膜和耐藥性的影響可能通過兩種不同的途徑發(fā)揮作用[21]。銅綠假單胞菌也同樣被用來研究失重狀態(tài)下生物被膜的形成，與大腸埃希菌相似，模擬失重暴露后的銅綠假單胞菌也形成更厚更穩(wěn)定的生物被膜。模擬失重并不是直接通過誘導(dǎo)N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯增加細(xì)菌毒力，而是通過啟動信號級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生超強(qiáng)毒性的銅綠假單胞菌[15]。

細(xì)菌生物被膜除了與人的感染性疾病有關(guān)，還能對金屬材料產(chǎn)生腐蝕作用，在航天活動中可能腐蝕航天飛船或空間站的設(shè)備，因此研究空間環(huán)境對細(xì)菌生物被膜的影響至關(guān)重要。Mauclaire等[22]研究了兩株從國際空間站上獲得的藤黃微球菌菌株(LT100和LT110)，應(yīng)用微量BCA蛋白試劑盒以及苯酚-硫酸比色法測定了其蛋白和多糖的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與地面菌株比較空間菌株LT110可產(chǎn)生更多的膠質(zhì)碳水化合物，而LT100可產(chǎn)生更多的膠質(zhì)蛋白，但同時還發(fā)現(xiàn)與在常重力條件下培養(yǎng)的菌株比較，在模擬微重力條件下培養(yǎng)的上述兩株空間菌株以及地面對照株胞外多聚物質(zhì)(EPS)生成均有所下降。因此，微重力對細(xì)菌生物被膜的影響并不單一，可能與細(xì)菌種類有關(guān)。雖然微重力是航天活動中空間環(huán)境的主要因素，但對細(xì)菌生物被膜的影響可能還是多種因素共同作用的結(jié)果。

3 微重力對細(xì)菌環(huán)境抵抗力及耐藥性的影響

與地面常重力下生長的沙門菌相比，失重條件下生長的沙門菌表現(xiàn)出對環(huán)境刺激(如酸、熱、滲透)更強(qiáng)的抵抗力。針對酸性環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)，失重條件下生長的沙門菌抵抗力增強(qiáng)的機(jī)制并不依賴于RpoS的調(diào)節(jié)，但編碼鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(ferric iron uptake regulator，F(xiàn)ur)的基因及其相關(guān)基因(fepD、sufC、sufS和feoB)卻在模擬失重條件下發(fā)生變化，表明這些基因除了調(diào)控大腸埃希菌和沙門菌的鐵代謝，也參與調(diào)控其他生理過程(如耐酸)。研究還發(fā)現(xiàn)微重力暴露后的Fur突變菌株對酸性刺激沒有抵抗力。因此，F(xiàn)ur在模擬微重力暴露后沙門菌耐酸性增強(qiáng)機(jī)制中起著重要作用[23]。

早在1982年7月，Tixador等[24-25]從“禮炮7”空間站上法國航天員J. L. Chrien攜帶的共生菌叢中分離出金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，他們發(fā)現(xiàn)多黏菌素E和卡那霉素對大腸埃希菌的最低抑菌濃度與地面對照組相比從4mg/L增加到16mg/L，可見空間環(huán)境中大腸埃希菌產(chǎn)生了明顯的耐藥。而且紅霉素、氯霉素和苯唑西林對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度也呈現(xiàn)少量增加。即使在沒有抗生素存在的情況下，葡萄球菌在航天飛行中也出現(xiàn)了菌壁明顯增厚的現(xiàn)象，這種細(xì)菌形態(tài)的變化與地面上在多酚中生長的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[24]和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[26-28]非常相似。但細(xì)菌的這種耐藥性變化并不穩(wěn)定，在地面環(huán)境傳代培養(yǎng)，其抗生素敏感性和細(xì)菌形態(tài)還可恢復(fù)到飛行前狀態(tài)。1985年l1月在美國“挑戰(zhàn)者”號和1992年1月在“發(fā)現(xiàn)”號航天飛機(jī)上的實驗也進(jìn)一步證實了上述現(xiàn)象[29-30]。然而，微重力條件下不同細(xì)菌對抗生素耐藥性的變化并不一致。鮑曼不動桿菌在低剪切力模擬微重力的環(huán)境中對多種抗生素的最低抑菌濃度(MICS)并沒有明顯升高[31]。

4 前景展望

隨著航天事業(yè)的發(fā)展，人類遨游太空、探索星球不再是夢想，但是太空環(huán)境復(fù)雜，如何保障航天員的健康至關(guān)重要。研究表明，太空飛行中航天員免疫功能下降[32-33]，細(xì)菌毒力增加，導(dǎo)致航天員發(fā)生感染的概率增加。

目前，多項研究表明微重力可增加多種細(xì)菌的毒力和致病性，且與相關(guān)的毒力基因、蛋白表達(dá)有關(guān)，但也發(fā)現(xiàn)了很多相互矛盾的現(xiàn)象[7,10]，例如模擬微重力暴露后沙門菌TTSSs系統(tǒng)下調(diào)，某些參與核糖核酸代謝的毒力基因(pnp和vacB，分別編碼兩種核糖核酸外切酶)的表達(dá)并沒有變化。因此，關(guān)于微重力致細(xì)菌毒力增加的機(jī)制仍不明確。迄今為止，比較深入的發(fā)現(xiàn)是微重力所致細(xì)菌基因的變化主要受RNA結(jié)合蛋白Hfq的調(diào)控。

此外，微重力對細(xì)菌的影響并非完全一致，不同細(xì)菌在微重力條件下的毒性、基因水平改變及抗生素耐藥性變化等都有所不同，例如Tucker等[34]發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌MG1655經(jīng)模擬微重力暴露后，并無特殊的微重力應(yīng)答基因表達(dá)，發(fā)生變化的基因與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，這一點(diǎn)不同于前述對沙門菌、致病性大腸埃希菌和產(chǎn)毒性大腸埃希菌的研究結(jié)果。目前對于致病菌的研究大多集中在腸道致病菌，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌也有少量的相關(guān)研究，但迄今為止，在“和平號”空間站(Mir)和國際空間站(International Space Station，ISS)上分離到的微生物遠(yuǎn)不止這些，除上述細(xì)菌外，還包括流感嗜血桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、陰溝腸桿菌、鏈球菌屬等可致病的革蘭陰性和陽性菌[35]。因此有關(guān)微重力對航天員細(xì)菌感染的影響仍有諸多問題亟待解決：微重力環(huán)境下多種可致呼吸道和消化道感染的細(xì)菌的致病性、耐藥性等生理病理變化及其機(jī)制；微重力暴露后致病菌所致感染有何特點(diǎn)，宿主的反應(yīng)與常重力對照組有何不同；經(jīng)航天員或航天器攜帶返回地面的致病菌是否會對地面人群尤其是免疫力低下的人群產(chǎn)生嚴(yán)重危害等。此外，進(jìn)行微重力對細(xì)菌生物效應(yīng)影響的研究也有助于我們更好地理解重力對細(xì)菌的影響。

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