張舒亞， 諶鴻超， 宋 青， 高 琴，呂 蓉， 李 想， 劉月明， 李富威

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306）

在動(dòng)物產(chǎn)品原料和加工產(chǎn)品中，經(jīng)常出現(xiàn)成分的摻假造假和無意污染現(xiàn)象。人為攙假主要是不法商要降低成本或增加品質(zhì)，以謀取巨額經(jīng)濟(jì)利益，如三聚氰胺奶粉、地溝油、染色饅頭事件等，這是欺詐違法行為。這種摻假造假、以次充好的行為除了嚴(yán)重?cái)_亂我國經(jīng)濟(jì)秩序，另一個(gè)最主要影響是危害人體健康和畜禽安全。在加工產(chǎn)品的造假摻假過程中，經(jīng)常會(huì)使用有毒有害物質(zhì)（如染色饅頭等），危害人民身體健康。瘋牛病和禽流感的世界性爆發(fā)和流行，人們?cè)絹碓疥P(guān)注食品安全和飼料安全。部分人群因?yàn)榻】稻壒室仓皇秤盟厥巢糠?。瘋牛病的發(fā)生是由于反芻動(dòng)物食用了含有動(dòng)物成分的飼料，所以各國禁止含有動(dòng)物成分的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物。由于含有禽成分的飼料可能具有傳播禽流感的風(fēng)險(xiǎn)，用這些摻假的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，會(huì)影響畜禽的健康生長(zhǎng)及我們的畜牧業(yè)安全?！吨腥A人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》、《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》和《食品標(biāo)識(shí)管理規(guī)定》（國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局令第102號(hào)）等法律法規(guī)禁止產(chǎn)品的造假摻假行為和正確標(biāo)識(shí)食品標(biāo)簽。

為保持產(chǎn)品的真實(shí)性，國內(nèi)外研究學(xué)者建立了食品和飼料中牛、羊、豬等多種物種成分以及魚翅等高附加值產(chǎn)品的檢測(cè)方法[1-9]。目前對(duì)火雞源性成分檢測(cè)研究報(bào)道還不多，國內(nèi)還未見火雞源性成分檢測(cè)的研究報(bào)道。作者采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)火雞成分進(jìn)行鑒定，確保火雞及相關(guān)產(chǎn)品的真實(shí)性，該方法的推廣應(yīng)用對(duì)保障產(chǎn)品質(zhì)量安全，保護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)，打擊摻假造假違法行為和保護(hù)畜牧業(yè)健康發(fā)展等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

火雞、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子、鵪鶉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、梅花鹿肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、兔肉、野兔肉、野豬肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草蝦、螃蟹、甲魚、牡蠣、貽貝、蝸牛等27種動(dòng)物材料:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市；大豆、玉米、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、番茄、豌豆、蘋果、胡蘿卜等10種常見植物材料:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市；15批進(jìn)口凍火雞腿肉、火雞脯肉和火雞頸肉，10個(gè)進(jìn)口未標(biāo)識(shí)火雞成分的食品（包括面包、香腸、餅干等），20批雞肉骨粉飼料，20批其他成分飼料（包括豬腸膜蛋白粉、多福蛋白、乳清粉、寵物飼料等）:由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。2個(gè)國內(nèi)市場(chǎng)火雞產(chǎn)品，各6種雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等30種禽肉和蛋產(chǎn)品，20批其他成分食品（肉干、肉醬、餅干、罐頭等）:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市。

1.2 試劑

CTAB提取緩沖液:20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0。蛋白酶K:20 mg/mL。CTAB沉淀溶液:5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl。氯仿（三氯甲烷）。70%乙醇。TE 緩沖液（Tris-Cl、EDTA 緩沖液）:10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。 實(shí)時(shí)熒光PCR混合液:Taqman Gene Expression Master Mix（AB 公 司 ，Part No.4369016）。 PCR 預(yù) 混 合 液:Premix Ex Taq Version2.0 （TaKaRa 公 司 ，Code:D332A）。 超純水（ddH2O）。

火雞源性檢測(cè)正向引物:5’-GCC CTA ACC CCT TAA GAA AAG AAT-3’，反向引物:5’-AGT TGC TAT GGC TAA GTC AAG TTT ACA C-3’，探針:5’-FAM-CTT GCT TGA GCC ACA CC-MGB-3’。

18S rRNA檢測(cè)引物:5’-TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3’ 和 5’-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3’。

1.3 儀器設(shè)備

ABI 7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀，天平，移液槍，離心機(jī)，恒溫孵育器，冷凍碾磨機(jī)，DNA冷凍干燥離心機(jī)，核酸蛋白濃度分析儀，Eppendorf離心管，PCR反應(yīng)管。

1.4 樣品的制備

用冷凍研磨機(jī)將上述植物材料和動(dòng)物材料樣品研磨成粉狀。使用冷凍研磨機(jī)將雞肉和火雞肉磨成粉末狀，并于60℃烘干3 h。用雞肉粉與火雞肉粉混合，配制成分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.000 1%火雞肉粉的混合樣品。

1.5 DNA的提取

將樣品研磨后，稱取100 mg樣品于2 mL離心管中，加入1.5 mL CTAB提取緩沖液和10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶液。60℃振蕩過夜后13 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750 μL氯仿后用力振蕩，13 000 g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液，室溫靜置60 min，13 000 g離心15 min，棄去上清。加入350 μL NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮。再加入350 μL氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20 min，13 000 g離心10 min，棄去上清液。加入500 μL 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200 μL TE溶液中，用核酸蛋白含量測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，也可用等效的商業(yè)化DNA提取試劑盒提取模板DNA。

1.6 DNA濃度測(cè)定及配制

用德國Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定抽提樣品DNA的質(zhì)量濃度。

用雞肉DNA溶液（質(zhì)量濃度100 ng/μL）將抽提的火雞肉 DNA溶液（濃度 100 ng/μL）稀釋成 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL DNA 混合液，用于靈敏度測(cè)試。

1.7 PCR測(cè)試

過敏原大豆成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系:實(shí)時(shí)熒光PCR混合液12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，模板 DNA 100 ng，水補(bǔ)足至25 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40 個(gè)循環(huán)。

18S rRNA基因引物PCR反應(yīng)體系:PCR預(yù)混合液 12.5 μL，引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，模板 100 ng， 反應(yīng)體積為 25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃，3 min；94 ℃，20 s，54 ℃，40 s，72 ℃，40 s，40 個(gè) 循環(huán) ；72℃，5 min。取 10 μL PCR 產(chǎn)物，加 1 μL 10×上樣緩沖液點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)所用的凝膠質(zhì)量濃度為1.5～2.0 g/dL。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物特異引物18S rRNA引物的檢測(cè)結(jié)果

18S rRNA基因在真核生物中高度保守，18S rRNA基因特異引物在真核生物DNA中均能有效擴(kuò)增，常用于真核生物的內(nèi)參照基因。用真核生物18S rRNA特異引物擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)提取的所有DNA溶液（包括各種動(dòng)物或植物材料的DNA溶液），所有DNA溶液均能出現(xiàn)137 bp的特異擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，所有抽提的DNA溶液適合于PCR測(cè)試。

2.2 火雞成分的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)

以火雞12S rRNA基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)火雞檢測(cè)引物和探針序列。用火雞源性檢測(cè)引物對(duì)火雞和供試的其他動(dòng)物和植物進(jìn)行檢測(cè)，在火雞DNA中出現(xiàn)擴(kuò)增，而在雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子、鵪鶉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、梅花鹿肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、兔肉、野兔肉、野豬肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草蝦、螃蟹、甲魚、牡蠣、貽貝、蝸牛、大豆、玉米、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、番茄、豌豆、蘋果、胡蘿卜等36種常見動(dòng)植物材料DNA樣品中均無擴(kuò)增，見圖1。這說明該檢測(cè)方法具有物種特異性。

圖1 火雞源性引物探針特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖譜Fig.1 Specific detection of real-time PCR for turkey

2.3 火雞成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度

對(duì) 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL火雞 DNA 進(jìn)行檢測(cè)， 在 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL火雞DNA中出現(xiàn)擴(kuò)增，在0.000 01 ng/μL火雞DNA中未出現(xiàn)擴(kuò)增，見圖2。實(shí)驗(yàn)表明，火雞源性檢測(cè)引物檢測(cè)靈敏度為0.000 1 ng/μL火雞DNA。

圖2 火雞DNA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度圖譜Fig.2 Amplification curve generated by serial dilution of turkey DNA

用雞肉粉10倍系列混合配制不同含量的火雞肉粉樣品。使用火雞成分引物和探針對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和 0.0001%火雞肉粉的樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)。10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%火雞肉粉均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而0.000 1%火雞肉粉未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，見圖3。實(shí)驗(yàn)表明，該方法的檢測(cè)靈敏度為0.001%（10 mg/kg）火雞肉粉。

圖3 火雞肉粉質(zhì)量比的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度圖Fig.3 Amplification curve generated by different turkey percentage

2.4 食品中火雞成分檢測(cè)的應(yīng)用

使用建立的檢測(cè)方法對(duì)15個(gè)進(jìn)口火雞產(chǎn)品、10個(gè)、52個(gè)國內(nèi)市場(chǎng)流通的市售食品以及進(jìn)口40批飼料進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用性。經(jīng)對(duì)117個(gè)食品和飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，在15批進(jìn)口樣品和2個(gè)國內(nèi)火雞產(chǎn)品中檢測(cè)出火雞成分，檢測(cè)結(jié)果與食品成分相符；在10個(gè)進(jìn)口未標(biāo)識(shí)火雞成分的食品，國內(nèi)市場(chǎng)的30個(gè)禽肉蛋制品和20批其他成分食品中未檢出火雞成分，檢測(cè)結(jié)果與食品成分相符；在1批美國進(jìn)口的雞肉骨粉飼料檢出火雞成分，在其他的19批雞肉骨粉飼料和20批其他成分飼料未檢出火雞成分，見表1。結(jié)果表明，研究建立檢測(cè)方法能夠適用于食品和飼料的火雞源性成分檢測(cè)。

表1 食品和飼料中火雞源性成分檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of commercial food and feed samples

3 結(jié)語

目前對(duì)物種成分的鑒定，基本上是采用生物技術(shù)手段，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)（如ELISA）和核苷酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)（如PCR）。PCR檢測(cè)方法由于其高特異性和高靈敏度廣泛應(yīng)用于加工產(chǎn)品（尤其是深加工產(chǎn)品）的檢測(cè)[1-13]。12S rRNA基因序列由于保守特異而常被選用于動(dòng)物源性成分鑒別，I Martín 和 Miguel A Rodríguez 報(bào) 道 了 以 12S rRNA為檢測(cè)靶標(biāo)的火雞普通PCR檢測(cè)方法[11-12]，其檢測(cè)限為0.1%～1%。2012年Zulal Kesmen報(bào)道了基于火雞NADH脫氫酶檢測(cè)靶標(biāo)的檢測(cè)方法，其檢測(cè)限為0.001%[13]。作者以火雞12S rRNA基因?yàn)榘袠?biāo)，研究建立了食品和飼料中火雞成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)限為0.001%（10 mg/kg），能準(zhǔn)確檢測(cè)出食品和飼料中的火雞成分，為食品和飼料中火雞成分檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化提供了依據(jù)。

[1]Miguel A Rodríguez，Teresa García，Isabel González，et al.PCR identification of beef，sheep，goat，and pork in raw and heattreated meat mixtures[J].J Food Prot，2004，67（1）:172-177.

[2]Miguel A Rodríguez，Teresa García，Isabel González.Quantitation of mule duck in goose foie gras using taqman real-time polymerase chain reaction[J].J Agric Food Chem，2004，52（6）:1478-1483.

[3]張舒亞，金麗琴，蔣劍瓊，等.食品中魚源性成分PCR檢測(cè)方法研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，1:142-145.ZHANG Shu-ya，JIN Li-qin，JIANG Jian-xiong，et al.Identification of fish derived material in food[J].Food and Fermentation Industries，2010，1:142-145.（in Chinese）

[4]張舒亞，呂蓉，劉月明，等.硫酸軟骨素中摻假動(dòng)物成分檢測(cè)方法研究[J].食品工業(yè)科技，2009，1:309-318.ZHANG Shu-ya，LV Rong，LIU Yue-ming，et al.Identification of animal derived material in chondroitin sulfate[J].Science and Technology of Food Industry，2009，1:309-318.（in Chinese）

[5]張舒亞，管薇薇，劉月明，等.飼料中魚源性成分真實(shí)性鑒別研究[J].飼料研究，2009，6:45-48.ZHANG Shu-ya，GUAN Wei-wei，LIU Yue-ming，et al.Identification of fish derived material in feed[J].Feed Research，2009，6:45-48.（in Chinese）

[6]張舒亞，李艷，潘良文.雞精調(diào)味料中雞源性成分真實(shí)性鑒別研究[J].中國調(diào)味品，2007，12:60-62.ZHANG Shu-ya，LI Yan，PAN Liang-wen.Identification of chicken derived material in chicken essence seasoning[J].China Condiment，2007，12:60-62.（in Chinese）

[7]郭云霞，冒海琳，張舒亞，等.魚翅的分類及鑒別方法[J].食品工業(yè)，2011，6:96-99.GUO Yun-xia，MAO Hai-lin，ZHANG Shu-ya，et al.Classification and identification of shark fin[J].The Food Industry，2011，6:96-99.（in Chinese）

[8]郭云霞，包建強(qiáng)，張舒亞，等.食品中鯊魚源性成分真實(shí)性PCR鑒別研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（10）:421-42.GUO Yun-xia，BAO Jian-qiang，ZHANG Shu-ya，et al.Authentication of shark derived material in food using PCR[J].Science and Technology of Food Industry，2011，32（10）:421-42.（in Chinese）

[9]趙文靜，李 妍，高鵬飛，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在乳酸菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28（4）:289-294.ZHAO Wen-jing，LI Yan，GAO Peng-fei，et al.Application of real-time fluorescent quantitative PCR in quantitative detection of laatic acid bateria[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（4）:289-294.（in Chinese）

[10]劉光明，蘇文金，梁基選，等.多重PCR方法檢測(cè)食品中轉(zhuǎn)基因成分[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，21（4）:379-383.LIU Guang-ming，SU Wen-jin，LIANG Ji-xuan，et al.Multiplex PCR for detecting transgenic component in foods[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2002，21（4）:379-383.（in Chinese）

[11]I Martín，T García，V Fajardo，et al.Technical note:detection of chicken，turkey，duck，and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction[J].Journal of Food Science，2007，85（2）:452-458.

[12]Miguel A Rodríguez，Teresa García，Isabel González，et al.Identification of goose，mule duck，chicken，turkey，and swine in foie gras by species-specific polymerase chain reaction[J].J Agric Food Chem，2003，51（6）:1524-1529.

[13]Zulal Kesmen，Ahmet E.Yetiman，F(xiàn)ikrettin Sahin，et al.Detection of chicken and turkey meat in meat mixtures by using realtime PCR assays[J].Journal of Food Science，2012，77（2）:167-173.