徐波，蘇娃婷，徐金金，劉慧敏，夏中元，夏正遠(yuǎn)，雷少青

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050;2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060;3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001)

肺缺血再灌注損傷(pulmonary ischemia-reperfusion injury，LIRI)可發(fā)生于肺移植、心肺移植、心肺轉(zhuǎn)流、心肺復(fù)蘇、肺溶栓等多種臨床情況［1］。其特征是肺血管通透性增加、肺動脈高壓、肺水腫、肺氣管痙攣、肺通氣受損［2］，從而影響病人恢復(fù)，嚴(yán)重時導(dǎo)致病人手術(shù)失敗而使死亡率增高。缺血后處理(ischemic postconditioning，IPO)是近年Zhao 等［3］報道的一種內(nèi)源性心臟保護現(xiàn)象，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前證實，IPO 也可在肝、腦、腎、脊髓、平滑肌等心臟外器官中具有保護作用。然而，IPO 在肺臟中的保護作用目前較少研究，特別是IPO 在抗肺缺血再灌注損傷中的作用機制仍然不明。

近年研究顯示，IPO 發(fā)揮保護作用與生存活化因子增強(survivor activating factor enhancement，SAFE)通路，特別是Janus 激酶(JAK)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT-3)途徑有關(guān)［4］。在我們前期研究中，IPO 抗肺缺血再灌注損傷還與血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)的表達及活性增加有關(guān)［5，6］。新近研究顯示，HO-1 可誘導(dǎo)STAT-3 的活化而發(fā)揮抗肝缺血再灌注損傷作用［7］。然而，IPO所誘導(dǎo)的HO-1 是否也通過促進STAT-3 活化而發(fā)揮抗肺缺血再灌注損傷作用目前未見相關(guān)報道。本研究通過建立肺缺血再灌注損傷模型，旨在進一步探討HO-1 在IPO 抗LIRI 中的作用機制及其對STAT-3 蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及手術(shù)操作

清潔級雄性SD 大鼠，6 ～7 周齡，體重250 ～280 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供【SCXK(鄂)2008-0004】。實驗在武漢大學(xué)動物實驗中心進行【SYXK(鄂)2008-0004】。戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，氣管切開后氣管內(nèi)插管連接TKR-200C型小動物呼吸機控制呼吸，呼吸頻率:60 次/分，呼吸比為1∶1.5，工作壓力(即潮氣量):0.02 MPa。經(jīng)左胸第5 肋間進入胸腔，游離左側(cè)肺門，穿一根阻斷帶。

1.2 實驗分組

1)假手術(shù)組(S 組):不阻斷肺門，持續(xù)灌注105 min;2)缺血再灌注組(IR 組):缺血45 min 后，再灌注60 min;3)缺血后處理組(IPO 組):缺血45 min后，短暫再灌注1 min，缺血1 min，反復(fù)5 次，然后再灌注60 min ;4)缺血后處理+ HO-1 抑制劑組(IPO+ZnPP 組):實驗前24 h 腹腔注射HO-1 的特異性抑制劑zinc protoporphyrin IX(ZnPP，20 mg/kg，美國Sigma 公司)。

1.3 肺水腫程度檢測:肺的干/濕比(W/D)

再灌注結(jié)束時，實施胸骨正中劈開手術(shù)，通過升主動脈離斷處死大鼠。從胸腔中切除肺葉，左肺稱重后置于90℃烘箱中24h。干燥過程結(jié)束后再稱重，計算肺的干/濕比。肺水腫程度由此比值描述。

1.4 丙二醛(MDA)含量、MPO 及HO-1 活性測定(W/D)

取組織置于液氮0.5 h 后凍存于－80℃，留待測酶活性或者蛋白表達。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化損傷的特異指標(biāo)。MPO 是PMN 聚集的特征酶，是白細(xì)胞浸潤肺實質(zhì)的標(biāo)志。分別用試劑盒(南京建成科技有限公司)檢測MDA 含量、MPO 及HO-1 活性，操作方法嚴(yán)格按照其說明書進行。

1.5 免疫共沉淀分析HO-1 與STAT-3 蛋白的相互作用關(guān)系

具體方法如下:心肌組織于溫和裂解液(含60 mmol/L N-octyl-glucopyranoside)中勻漿、冰上裂解30 min，1000 g 離心15 min，收集上層液體并進行蛋白定量。取500 μg 蛋白樣品與2 μg 相應(yīng)的一抗4℃下輕微震蕩孵育2 h，后加入20 μL 重懸的Protein A/G Plus-Agarose(Santa Cruz Biotechnology)4℃震蕩過夜。4℃下1000 g 離心收集沉淀，PBS(含蛋白酶抑制劑)洗滌4 次。1 × SDS 上樣緩沖液重懸沉淀，95℃變性5 min 后用于Western blot 分析。

1.6 Western blot 檢測HO-1、STAT-3 蛋白的表達

分離各組大鼠的肺組織，加入RIPA 裂解緩沖液，冰浴1 h，4℃、14 000 r/min 離心，取上清為組織總蛋白;嚴(yán)格按照碧云天生物蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法進行蛋白定量?？偟鞍咨蠘恿繛?00 μg，8%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜;5% 脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，洗膜后加入一抗，4℃過夜，再度洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶5000稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜后加ECL 試劑發(fā)光，用Quantity One 軟件對條帶進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗大鼠肺干濕比(W/D)及生化檢測指標(biāo)

如表1 所示，IR 組大鼠W/D、MDA 及MPO 水平與S 組比較均顯著增加(P ＜0.05 或0.01)，IPO組大鼠中上述檢測指標(biāo)與IR 組比較均降低;經(jīng)HO-1 特異性抑制劑ZnPP 處理后，IPO +ZnPP 組大鼠W/D、MDA 及MPO 與IR 組大鼠比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)，提示HO-1 抑制劑ZnPP 完全取消了IPO 對W/D、MDA 及MPO 的作用。

2.2 各組實驗大鼠肺組織中HO-1 活性及蛋白表達情況

如圖1 所示，IR 組HO-1 活性及蛋白表達水平與S 組比較均增加，IPO 可以促進HO-1 活性及蛋白表達水平進一步增加，經(jīng)HO-1 特異性抑制劑ZnPP處理后，HO-1 的活性及蛋白表達顯著降低，提示HO-1 抑制劑ZnPP 完全可以取消IPO 對HO-1 的活性及蛋白表達水平的影響。

表1 各組大鼠W/D、MDA 及MPO 比較(n = 10，±s)Tab.1 Comparison of W/D，MDA and MPO in the rats

表1 各組大鼠W/D、MDA 及MPO 比較(n = 10，±s)Tab.1 Comparison of W/D，MDA and MPO in the rats

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 與S 組比較，#P ＜0.05 與IR 組比較。S:假手術(shù)組;IR:缺血再灌注組;IPO 缺血后處理組;IPO +ZnPP:缺血后處理+HO-1 抑制劑ZnPP 組。Note:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，vs.group S，#P ＜0.05，vs.group IR;S:Sham group;IR:Ischemia-reperfusion group;IPO:Ischemicpostconditioning group;IPO + ZnPP:Ischemia-reperfusion plus ZnPP group.

組別Groups W/D MDA(nmol/mg protein)MPO(U/g wet tissure)S 組4.49 ±0.32 32.15 ±5.35 1.18 ±0.24 IR 組 6.65 ±0.64＊＊ 79.65 ±7.43＊＊ 2.27 ±0.41*IPO 組 5.31 ±0.42* # 58.69 ±6.52* # 1.63 ±0.33#IPO+ZnPP 組 6.90 ±0.65＊＊ 73.62 ±7.98＊＊ 2.20 ±0.29*

圖1 IPO 對HO-1 活性(A)及蛋白表達水平(B)的影響Fig.1 Effects of IPO on the HO-1 activity and expression of HO-1 protein in the rats.

2.3 各組實驗大鼠缺血肺組織中p-STAT-3 蛋白表達及其與HO-1 蛋白的相互作用關(guān)系

在肺缺血再灌注損傷中，與S 組比較，IR 可以顯著減少p-STAT-3 蛋白表達水平，而IPO 可以恢復(fù)p-STAT-3 表達水平(圖2A)，應(yīng)用HO-1 抑制劑可以抑制STAT-3 的磷酸化(圖2A);進一步免疫共沉淀結(jié)果顯示，HO-1 可以與STAT-3 形成蛋白復(fù)合體(圖2B)。

3 討論

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是缺血再灌注損傷的重要機制之一。在正常狀態(tài)下，大多數(shù)肺組織細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、膈細(xì)胞、纖毛氣道上皮細(xì)胞以及肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞等)均有產(chǎn)生ROS的能力，并具有一定的生理作用。但在肺缺血再灌注狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞大量浸潤，“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生過量氧自由基，從而導(dǎo)致肺組織損傷。在本實驗研究中，我們結(jié)果顯示缺血再灌注損傷可導(dǎo)致肺組織W/D、MDA 及MPO 增加，提示缺血肺組織水腫、中性粒細(xì)胞侵潤及氧化損傷增加。因此，闡明肺缺血再灌注狀態(tài)下氧化應(yīng)激的影響因素及分子機制是降低肺缺血再灌注損傷的重要途徑。

圖2 各組實驗大鼠肺組織p-STAT3 蛋白表達水平及HO-1 與STAT-3 的相互作用關(guān)系Fig.2 Expression of STAT3 protein in the rat lung tissues and relationship between HO-1 and STAT3.

血紅素加氧酶(hemeoxygenase，HO)是催化游離血紅素生成膽綠素、膽紅素、一氧化碳(CO )和鐵蛋白的限速酶。它具有三種同工酶:HO-1、HO-2、HO-3。其中，HO-1，也稱為熱休克蛋白32，是目前研究最多的一種血紅素加氧酶同工酶。在多種應(yīng)激狀態(tài)下(如缺血再灌注損傷)HO-1 可被迅速誘導(dǎo)增加，從而保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激等病理損傷，近年來被認(rèn)為是防治心血管疾病重要的治療靶點。HO-1可以減輕由免疫介導(dǎo)、氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的組織損傷，具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡等保護作用［8］，這種保護作用在組織缺血再灌注、器官移植排斥反應(yīng)中表現(xiàn)猶為明顯［9］。研究顯示，HO-1 在IPO 所致正常大鼠心臟及肝臟［10］缺血再灌注損傷保護中均起重要作用。本研究結(jié)果顯示，急性肺缺血再灌注損傷可促進HO-1 蛋白表達及活性的代償性增加，IPO 可進一步誘導(dǎo)HO-1 活性及蛋白表達的增加從而抗肺缺血再灌注損傷。

以往研究認(rèn)為［11］，IPO 與IPC 相似，主要通過激活再灌注損傷補救激酶(RISK)通路中的磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt途徑而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷作用。但近年研究顯示，IPO 發(fā)揮保護作用還與生存活化因子增強通路，特別是Janus 激酶(JAK)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-3 途徑有關(guān)。進一步研究顯示，SAFE 通路可獨立于RISK 通路而發(fā)揮心肌保護作用［12］。在STAT-3 基因敲除鼠模型中，IPO 不能發(fā)揮抗心肌缺血/再灌注損傷作用［13］。STAT-3 促進eNOS 活化所生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)是IPO 的重要調(diào)節(jié)因子［14］。這提示STAT-3 是IPO 抗組織缺血再灌注損傷的必要因子，但其具體調(diào)控機制仍然不明。新近研究顯示STAT-3 在調(diào)節(jié)肺炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。盡管如此，STAT-3 在IPO 抗LIRI 及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用機制未見報道。新近研究顯示，HO-1 可誘導(dǎo)STAT-3 的活化而發(fā)揮抗肝缺血再灌注損傷作用［7］。我們的結(jié)果顯示，在肺缺血再灌注損傷中，IPO 可促進HO-1 蛋白表達及活性的增加，同時伴隨p-STAT-3 表達水平增加;應(yīng)用HO-1抑制劑可以抑制STAT-3 的磷酸化，進一步免疫共沉淀結(jié)果顯示，HO-1 可以與STAT-3 形成蛋白復(fù)合體。這提示IPO 所誘導(dǎo)的HO-1 可通過促進STAT-3活化而發(fā)揮抗肺缺血再灌注損傷作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激是肺缺血再灌注損傷的重要機制，HO-1 是抗肺缺血再灌注損傷的重要途徑。缺血后處理可以通過促進HO-1 活性及蛋白表達的增加從而激活STAT-3 通路而發(fā)揮抗肺缺血再灌注損傷作用。本研究初步探討了HO-1/STAT-3 信號通路在缺血后處理抗肺缺血再灌注損傷中的作用機制，以期為臨床開發(fā)肺缺血再灌注損傷保護藥物或措施提供理論依據(jù)。

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