壽旗揚，潘永明，陸曄楓，張利棕，奚賽飛，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053)

心血管疾病是嚴(yán)重危害健康的常見病、多發(fā)病，而高血壓是冠心病、心肌梗死、腦卒中的主要危險因素之一［1］。高血壓的發(fā)病機制及如何進行有效的治療已成為當(dāng)前研究的熱點。高血壓動物模型是高血壓疾病和治療藥物研究的重要手段。其中檢測高血壓大鼠的血壓是高血壓藥物新藥的有效性和安全性評價研究中的重要環(huán)節(jié)。自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)是目前國際公認(rèn)最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，普遍用于高血壓發(fā)病機制及其治療藥物的藥效學(xué)評價研究。

SHR 大鼠是由日本學(xué)者Okamoto 和Aoki 培育，主要特征是高血壓，出生后第5 周齡開始血壓升高，10 周齡雄鼠收縮壓達180 mmHg，雌鼠170 mmHg，5～6月齡達高峰［2-3］。在傳統(tǒng)的血壓測量方法，會引起各種應(yīng)激，引起血壓、心率和體溫等生理參數(shù)的變化，甚至生化參數(shù)的改變，致使實驗結(jié)果的離散度大和重復(fù)性差，影響研究結(jié)果公認(rèn)性。因此本實驗應(yīng)用植入式遙測技術(shù)對SHR 大鼠在清醒無束縛狀態(tài)下進行血壓晝夜節(jié)律波動的研究，為臨床前抗高血壓藥物篩選和評價提供可靠的高血壓大鼠血壓晝夜變化基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SHR 大鼠，雄性，3月齡，8 只，來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2012-0001］。無菌手術(shù)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF 級屏障實驗室中進行［SYXK(浙)2008-0115］。以上實驗動物使用按3R 原則給予人道的關(guān)懷。術(shù)后每只大鼠稱重、標(biāo)記編號并單籠飼養(yǎng)以防相互干擾遙測信號。

1.2 儀器及試劑

DEM 小動物生理信號遙測系統(tǒng)(美國DSI);TL11M2-C50-PXT 遙測植入子(美國DSI);生理遙測系統(tǒng)-心電分析軟件(法國EMKA);AWS 臺式呼吸麻醉機(美國Hallowell);動物恒溫水泵(美國Hallowell);纖維蛋白膜(美國DSI 公司);異氟烷(山東魯南貝特制藥);生物膠(美國3M);其他物品:戊二醛、碘伏消毒液、顯微鑷、導(dǎo)管鑷和常規(guī)手術(shù)器械等。

1.3 C50-PXT 植入子植入手術(shù)

取8 只3月齡雄性SPF 級SHR 大鼠，適應(yīng)7d，禁食12 h 后，進行C50-PXT 植入子植入手術(shù)。手術(shù)器械和物品滅菌消毒。大鼠用異氟烷進行誘導(dǎo)麻醉，仰臥固定于37℃恒溫臺上，剃毛、常規(guī)消毒。沿腹中線作4 ～6 cm 的切口，用牽引器拉開切口，用生理鹽水潤濕的醫(yī)用紗棉將腹腔內(nèi)的腸道推至四周，用干潔的消毒棉簽分離腹主動脈的周圍脂肪和連接組織。從腹主動脈上清除殘留的組織。從無菌生理鹽水中取出植入體。從腹主動脈下方穿過2 號縫合線，用縫合線打結(jié)后稍微拉起動脈以暫時阻斷動脈血流。用21號針已彎折的尖端部分穿破主動脈。將導(dǎo)管輕輕插入血管1 ～2 cm。用生物膠和纖維蛋白膜粘合血管，15 ～20 s 后輕輕松開阻斷主動脈血液的縫合線。用棉簽從腹腔外輕輕向內(nèi)推壓腹部，使腸道恢復(fù)原位，將植入體植入已打開的腹腔內(nèi)，并使植入體上的縫線固定脊朝上放置(圖1 所示)。用3 號手術(shù)線不連續(xù)性地縫合傷口。手術(shù)后3 d 內(nèi)，每天腿部肌注青霉素防止感染。手術(shù)7 d 后進行實驗。

1.4 血壓數(shù)據(jù)采集和分析

信號將通過以無線的方式傳送給信號接收裝置，用DSI 遙測系統(tǒng)進行3月齡SHR 大鼠24 h 連續(xù)清醒無束縛血壓監(jiān)測，并用EMKA “ECG-Auto”V2.6.0.10 分析軟件對動態(tài)血壓均值、24 h 血壓趨勢等指標(biāo)進行分析。

圖1 C50-PXT 腹腔內(nèi)放置位點Fig.1 The intraperitoneal site of the C50-PXT implant placement

1.5 觀察指標(biāo)

大鼠動態(tài)心率均值:24 h、白晝階段(6∶00 ～18∶00)、夜間階段(18∶00 ～次日6∶00)的心率及24 h心率趨勢圖;動態(tài)血壓均值:24 h、白晝階段、夜間階段的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)平均壓(MBP)均值;24 h 血壓趨勢圖:24 h 收縮壓(SBP)或舒張壓(DBP)均值的曲線圖;白晝期間血壓下降率(diurnal blood pressure reduction rate，DBPR):(夜間血壓最高值－白晝夜間血壓最低值)/夜間血壓最高值，為判斷晝夜節(jié)律狀況的定量指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段心率的比較及24 h 心率趨勢變化

由表1 和圖2 可知，SHR 大鼠24 h 平均心率為337.27 次/分，夜間階段的平均心率明顯高于白晝階段(P ＜0.01)。夜間階段心率平均值為346.05 次/分，在20∶00 ～21∶00 和1∶30 ～2∶00 時出現(xiàn)兩個高峰期(心率峰值分別為375.00 次/分和373.26 次/分);白晝最低平均心率是328.85 次/分，在11∶00 左右出現(xiàn)一個谷底期(心率谷底為310.91 次/分)。

表1 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段心率和血壓比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of 24 h，day and night heart rate and blood pressure in the SHR rats

表1 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段心率和血壓比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of 24 h，day and night heart rate and blood pressure in the SHR rats

注:白晝階段與夜間階段比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.Note:The day stage compared with night stage，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

參數(shù)Parameter單位Units全天Whole day白晝階段Day 6:00 －18:00夜間階段Night 18:00 －6:00白晝期間血壓下降率(DBPR)/%心率Heart rate 次/分鐘time/min 337.27 ±17.55 328.85 ±11.13 346.05 ±18.77＊＊－收縮壓SBP mmHg 164.34 ±3.52 162.73 ±2.93 166.02 ±3.32＊＊ 10.92舒張壓DBP mmHg 121.34 ±3.52 119.64 ±2.90 123.04 ±3.29＊＊ 12.70平均壓MBP mmHg 142.34 ±3.52 140.64 ±2.90 144.04 ±3.29＊＊11.36

圖2 SHR 大鼠24 h 心率趨勢變化Fig.2 Trend changes of 24 h heart rate in the SHR rats

2.2 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段收縮壓(SBP)的比較及趨勢變化

由表1 和圖3 可知，SHR 大鼠24 h 平均收縮壓為164.34 mmHg;白晝階段平均收縮壓明顯低于夜間階段(P ＜0.01)，夜間階段平均收縮壓為166.02 mmHg，在20∶30 ～21∶30 和1∶30 ～2∶30 出現(xiàn)兩個收縮壓高峰期(收縮壓峰值分別為172.13 mmHg 和171.38 mmHg);白晝平均收縮壓是162.73 mmHg，在14∶00 ～14∶30 出現(xiàn)一個收縮壓谷底期(收縮壓谷底為155.73 mmHg)。白晝期間收縮壓下降率為10.92%。

2.3 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段舒張壓的比較及趨勢變化

由表1 和圖4 可知，SHR 大鼠24 h 平均舒張壓為121.34 mmHg;白晝階段平均舒張壓明顯低于夜間階段(P ＜0.01)，夜間階段平均舒張壓為123.04 mmHg，在20∶30 ～21∶30 和1∶30 ～2∶30 出現(xiàn)兩個舒張壓高峰期(舒張壓峰值分別為129.14 mmHg 和128.38 mmHg);白晝平均舒張壓是119.64 mmHg，在14∶00 ～14∶30 出現(xiàn)一個舒張壓谷底期(舒張壓谷底為112.73 mmHg)。白晝期間舒張壓下降率(DBPR)為12.70%。

圖3 SHR 大鼠24 h 收縮壓趨勢變化Fig.3 Trend changes of 24 h systolic blood pressure in the SHR rats

圖4 SHR 大鼠24 h 舒張壓趨勢變化Fig.4 Trend changes of 24 h diastolic blood pressure in the SHR rats

2.4 SHR 大鼠24 h、白晝階段、夜間階段平均壓的比較及趨勢變化

由表1 和圖5 可知，SHR 大鼠24 h 平均壓為142.34 mmHg;白晝階段平均壓明顯低于夜間階段(P ＜0.01)，夜間階段平均壓為144.04 mmHg，在20∶30 ～21∶30 和1∶30 ～2∶30 出現(xiàn)兩個平均壓高峰期(平均壓峰值分別為150.14 mmHg 和149.38 mmHg);白晝平均壓是140.64 mmHg，在14∶00 ～14∶30 出現(xiàn)一個平均壓谷底期(平均壓谷底為133.73 mmHg)。白晝期間平均下降率(DBPR)為11.36%。

圖5 SHR 大鼠24 h 平均壓趨勢變化Fig.5 Trend changes of 24 h mean blood pressure in the SHR rats

3 討論

測量動脈血壓是對高血壓病診斷及評價其嚴(yán)重程度的主要手段，在抗高血壓藥物篩選和評價中，大鼠的血壓測定是一個關(guān)鍵性問題。常用測量方法有直接測壓法與間接測壓法;直接測壓法需要動脈插管，以PE10導(dǎo)管經(jīng)股動脈插至腹主動脈測壓為例，存在的缺點是導(dǎo)管順應(yīng)性和導(dǎo)管過長導(dǎo)致動態(tài)響應(yīng)較差，會使血壓數(shù)據(jù)誤差，導(dǎo)管皮下隧道和馬甲限制了動物活動范圍，而且導(dǎo)管會牽拉自身皮膚和肌肉導(dǎo)致疼痛。間接測壓法較常用的是清醒無創(chuàng)尾動脈測壓，可避免手術(shù)損傷，能夠在研究過程中對動物生理參數(shù)進行周期采樣，但存在的缺點是無法實時測定血壓，對于血壓的急劇變化不能及時檢測，且大鼠受加溫、束縛、尾部加壓等操作刺激的影響，處于一定的緊張應(yīng)激狀態(tài)，因此所測血壓值往往高于自由活動狀態(tài)下的血壓值［4-5］。

與傳統(tǒng)測定血壓方法對比，植入式遙測技術(shù)為在體監(jiān)測多項生理參數(shù)提供了一種新方法，能避免麻醉、應(yīng)激對實驗動物的影響，可在自由活動、清醒、有意識等情況下進行長時間持續(xù)記錄血壓。因此該系統(tǒng)所采集的數(shù)據(jù)能更好地模擬藥物在人體應(yīng)用的情況，避免許多藥物假陽性、假陰性情況的發(fā)生;實驗動物可以做自身對照和實驗結(jié)果準(zhǔn)確性可靠性提高，可降低試驗所需的動物數(shù)量［6-9］。而且避免了動物福利受損問題，達到“減少、代替、優(yōu)化”的“3R”原則。國際人用藥物注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會(ICH)原則已將遙測血壓測定技術(shù)列入安全性藥理試驗中，我國SFDA 指導(dǎo)原則也推薦使用該技術(shù)，用清醒動物的遙測技術(shù)代替麻醉動物進行藥物安全性評價，尤其是安全性藥理學(xué)的評價［10］。

SHR 大鼠血壓升高或腦卒中發(fā)生過程中，其生理行為可能隨之變化。在高血壓大鼠生長的早期，其血管阻力持續(xù)增加，血壓升高，心肌肥大，機體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，這一過程持續(xù)進展到其生存的晚期，并發(fā)展為更嚴(yán)重的心肌肥大和充血性心功能衰竭。隨著高血壓的持續(xù)發(fā)展，高血壓大鼠出現(xiàn)了與人類高血壓患者相似的并發(fā)癥為腦和心肌損害，以及腎硬化，因此被廣泛應(yīng)用于人類高血壓的研究及抗高血壓藥物篩選和評價［11］。因此用遙測技術(shù)來研究SHR 大鼠血壓的變化規(guī)律，能保證數(shù)據(jù)的正確性和結(jié)果的可靠性。

本試驗利用遙測技術(shù)獲得3月齡的SHR 大鼠血壓和心率變化規(guī)律。在實驗過程中未發(fā)現(xiàn)SHR大鼠異常情況，說明植入子植入腹主動脈后，對大鼠心血管及其整體供血的無影響。實驗結(jié)果表明，SHR 大鼠心率低谷出現(xiàn)在11∶00 左右，20∶00 ～21∶00 和1∶30 ～2∶00 時出現(xiàn)兩個高峰，而白晝階段的平均心率明顯小于夜間階段。MBP、DBP 和SBP 的低谷出現(xiàn)在14∶00 ～14∶30，高峰期出現(xiàn)在20∶30 ～21∶30 和1∶30 ～2∶30 兩個時間段。SHR 大鼠血壓的變化與心率變化趨勢基本相同，白晝均低于夜間，且在白晝出現(xiàn)1 個24 h 血壓最低點，夜間出現(xiàn)2 個最高點，所不同的是血壓達到最低和最高的時間點與心率存在差異，血壓最低值出現(xiàn)在白晝14∶00 ～14∶30，而心率的最低點出現(xiàn)白晝的11∶00 左右，說明心率下降要早于血壓的降低。此外，從白晝期間血壓下降率來看，SHR 大鼠收縮壓、舒張壓和平均壓的DBPR 分別為10.92%，12.70%和11.36%，以舒張壓的降低幅度最大。值得注意的是SHR 大鼠血壓最高數(shù)值大致出現(xiàn)在21∶00 和2∶00 時，而最低血壓值是在14∶00 左右，這3 個時間點的獲得為實驗觀察和給藥時間的確定提供了實驗依據(jù)。

利用遙測技術(shù)觀察到SHR 大鼠心率和血壓晝夜呈白晝低夜間高的規(guī)律波動，心率和血壓平均值均為夜間階段大于白晝階段，心率和血壓的最低值出現(xiàn)在白晝，而最高值則出現(xiàn)在夜間，與大鼠晝伏夜動的特性相吻合。遙測技術(shù)可對清醒自由狀態(tài)下SHR 大鼠血壓進行連續(xù)監(jiān)測，能真實反映大鼠血壓變化規(guī)律，為自發(fā)性高血壓大鼠在高血壓發(fā)病機理和抗高血壓藥物篩選評價研究中提供一定背景數(shù)據(jù)，因此該技術(shù)值得進一步推廣和運用。

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