張 雯， 齊香君， 李彥軍

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose, 簡稱BC)是由醋酸桿菌(Acetobacterxylinum)高效合成的纖維素，其最終合成依賴于纖維素合成酶完成，纖維素合成酶表達(dá)量的多少，酶活力的高低，直接影響到BC的合成及產(chǎn)量高低.環(huán)鳥苷酸(cGMP)是纖維素合成酶的變構(gòu)激活劑，如果纖維素合成酶的變構(gòu)位點上沒有結(jié)合cGMP，纖維素合成酶將不具有活性.cGMP的合成與降解又與鳥苷酸環(huán)化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)有關(guān).GC催化cGMP的合成， PDE催化cGMP的降解[1-4].

欲提高纖維素合成酶活性，最有效的途徑就是消除PDE對cGMP的降解作用，增加其胞內(nèi)含量，提高細(xì)菌纖維素合成酶活力，最終提高BC產(chǎn)量.本研究通過將氨芐抗性基因(Ampr基因)插入至PDE編碼基因(pde基因)BanⅡ、BssHⅡ酶切位點(所得重組基因記為pde′)，使pde基因失活，將重組基因pde′克隆至質(zhì)粒pHSG398 EcoRⅠ、KpnⅠ酶切位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pde′-pHSG398.pde′-pHSG398轉(zhuǎn)化醋酸桿菌，利用同源雙交換使重組細(xì)胞內(nèi)pde′替換染色體上的pde基因，從而敲除醋酸桿菌的pde基因，使其喪失表達(dá)PDE的功能，構(gòu)建PDE失活型(PDE-)重組菌株，并利用加入氨芐青霉素及氯霉素的培養(yǎng)基篩選出PDE-重組菌株.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋酸桿菌(Acetobacterxylinum) 由本實驗室分離純化而得；質(zhì)粒pHSG398 日本Takara生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶BanⅡ、BssHⅡ、KpnⅠ、EcoRⅠ、Taq酶、T4連接酶、dNTPs、DNA Marker DL2000、Wide Range DNA Marker寶生物工程(大連)有限公司；Ampr基因 由質(zhì)粒pUC19經(jīng)PCR擴(kuò)增得到；pde基因引物、Ampr基因引物 利用primmer5.0軟件設(shè)計，由寶生物工程(大連)有限公司合成；氨芐青霉素、氯霉素.山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；固體培養(yǎng)基：蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，瓊脂1.8%，無水乙醇1.0%(v/v)，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，無水乙醇1.0%(v/v)，pH自然；氨芐青霉素培養(yǎng)基:蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，瓊脂1.8%，氨芐青霉素0.05%，無水乙醇1%(v/v)；氯霉素培養(yǎng)基:蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，瓊脂1.8%，氯霉素0.05%，無水乙醇1%(v/v).

PCR儀(MJ PTC-200) 美國MJ Research公司；電泳儀(DYY-10C)、電泳槽(DYCP-31D) 北京市六一儀器廠；高速臺式冷凍離心機(TGL-16M) 長沙湘儀離心機儀器有限公司；高速離心機(TGL-16C) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(MG250B)、恒溫振蕩器(HYG-1A) 上海新瑞儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡(XPS-8CA) 上海光學(xué)儀器有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀 德國Brucher公司.

1.2 分析方法

(1)DNA檢測[5]:瓊脂糖凝膠電泳法(電泳參數(shù)：U=60 V，I=50 mA，P=50 W)；

(2)BC膜處理[5]:將發(fā)酵所得BC膜浸泡于0.1 mol/L NaOH溶液中，80 ℃浸泡30 min，繼續(xù)加熱煮沸約2 h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到凝膠膜透明無色，pH為7.2；

(3)BC產(chǎn)量的測定[5]:靜態(tài)發(fā)酵BC膜處理后，用干燥濾紙吸干表面水分，105 ℃干燥至恒重，稱重.單位：g/L培養(yǎng)液；

(4)BC鑒定及基團(tuán)分析[6,7]:紅外光譜(樣品處理：將處理好的BC膜烘干后研成粉末，與溴化鉀以1∶100比例混合，充分研細(xì)，然后用壓片機壓片，再放入紅外光譜儀中進(jìn)行測定).

1.3 實驗方法

1.3.1 菌體細(xì)胞的收集及染色體DNA的提取[8,9]

取一定量醋酸桿菌種子培養(yǎng)液涂布于固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，刮菌膜于無菌水中，漩渦混合振蕩，脫脂棉過濾，12 000 rpm離心10 min收集沉淀，利用酚-氯仿抽提法提取染色體DNA.

1.3.2 醋酸桿菌pde基因的敲除[9,10]

(1)pde′基因的構(gòu)建及克隆

根據(jù)pde基因序列及Ampr基因序列[11]設(shè)計PCR引物，如表1所示.為便于pde′基因的構(gòu)建及與質(zhì)粒pHSG398的克隆，在Ampr基因PCR引物兩端分別添加限制性核酸內(nèi)切酶BanⅡ、BssHⅡ識別序列，在pde基因引物兩端分別添加限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ識別序列.PCR反應(yīng)過程中分別設(shè)置Mg2+濃度1 mM、2 mM、3 mM、4 mM，退火溫度46 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、54 ℃，考察其對PCR產(chǎn)物產(chǎn)量及特異性的影響.采用BanⅡ、BssHⅡ雙酶切分別切割pde基因、Ampr基因，利用T4連接酶將Ampr基因連接至pde基因BanⅡ、BssHⅡ酶切位點(所得重組基因記為pde′).采用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切分別切割pde′基因、質(zhì)粒pHSG398，將pde′基因連接至pHSG398EcoRⅠ、KpnⅠ酶切位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pde′-pHSG398.

表1 擴(kuò)增基因PCR引物序列

注：(1)引物的酶切位點用下劃線標(biāo)識

(2)PDE-重組細(xì)胞的構(gòu)建及篩選

采用CaCl2轉(zhuǎn)化法使重組質(zhì)粒pde′-pHSG398轉(zhuǎn)化醋酸桿菌細(xì)胞，利用pde′基因上所帶的氨芐抗性標(biāo)記及質(zhì)粒pHSG398上的氯霉素抗性標(biāo)記，采用影印法將轉(zhuǎn)化液分別涂布于氨芐青霉素培養(yǎng)基及氯霉素培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，篩選在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長而在氯霉素培養(yǎng)基上不生長的菌落30株，分別記為C1～C30，即為目的轉(zhuǎn)化子，即PDE-重組細(xì)胞.

1.3.3 PDE-重組菌株的發(fā)酵[5]

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接種醋酸桿菌出發(fā)菌株(Q)及PDE-重組菌株(C1～C30)，(接種量10%，發(fā)酵液裝量200 mL/500 mL燒杯)，30 ℃靜態(tài)培養(yǎng)4 d進(jìn)行BC的發(fā)酵生產(chǎn)(每個菌株3個平行實驗)，發(fā)酵結(jié)束后將BC凝膠膜按1.2.3所述方法進(jìn)行處理，測定BC產(chǎn)量并進(jìn)行BC膜IR檢測.

1.3.4 PDE-重組菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

將PDE-重組菌株(C1～C30)分別接種于氨芐青霉素培養(yǎng)基及氯霉素培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，驗證重組菌株的遺傳穩(wěn)定性能.

2 結(jié)果與討論

2.1 Mg2+濃度、退火溫度對pde基因、Ampr基因PCR擴(kuò)增的影響

2.1.1 Mg2+濃度對PCR的影響

按照1.3.2.1所述方法考察Mg2+濃度對pde基因、Ampr基因PCR擴(kuò)增的影響，實驗結(jié)果如表2所示.PCR產(chǎn)物結(jié)果表明，隨著Mg2+濃度升高，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量逐漸增多，而產(chǎn)物特異性逐漸降低，在Mg2+較高時，甚至出現(xiàn)多條非特異性雜帶.其原因為Taq酶活性的強弱依賴于游離Mg2+濃度的高低，從而影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，而PCR反應(yīng)體系中，模板的純度、dNTPs的含量以及引物濃度均會影響游離Mg2+濃度.實驗結(jié)果表明，pde基因PCR反應(yīng)體系中Mg2+最佳濃度為3 mM，Ampr基因PCR反應(yīng)體系中Mg2+最佳濃度為2 mM.

表2 Mg2+濃度對pde基因、Ampr基因PCR產(chǎn)物的影響

-：產(chǎn)物量極少；+：產(chǎn)物量較大，特異性好；++/+++：產(chǎn)物量大，但非特異性產(chǎn)物較多

2.1.2 退火溫度對PCR的影響

按照1.3.2.1所述方法考察退火溫度對pde基因、Ampr基因PCR擴(kuò)增的影響，實驗結(jié)果如表3、表4所示.PCR產(chǎn)物結(jié)果表明，pde基因PCR反應(yīng)退火溫度為50 ℃時，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量相對較高，且特異性好；Ampr基因PCR反應(yīng)退火溫度為36 ℃時，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量相對較高，且特異性好.其原因為在PCR反應(yīng)中，退火溫度的高低決定著PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量及特異性，復(fù)性溫度過低，引物之間易形成引物二聚體，或引物與模板易發(fā)生非特異性結(jié)合，形成非特異性產(chǎn)物；溫度過高，引物與模板結(jié)合效率降低，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量降低.

表3 不同復(fù)性溫度對pde基因PCR產(chǎn)物的影響

注：-：產(chǎn)物量極少或沒有；+：產(chǎn)物量較大，特異性好；++/+++：產(chǎn)物量大，但非特異性產(chǎn)物較多

表4 不同復(fù)性溫度對Ampr基因PCR產(chǎn)物的影響

注：-：產(chǎn)物量極少或沒有；+:產(chǎn)物量較大，特異性好；++/+++：產(chǎn)物量大，但非特異性產(chǎn)物較多

圖1 不同復(fù)性溫度下pde基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 不同復(fù)性溫度下Ampr基因PCR產(chǎn)物電泳圖

pde基因、Ampr基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳圖譜如圖1、圖2所示.由圖可知，pde基因PCR產(chǎn)物大小介于500 bp～750 bp之間，符合pde基因671 bp的大小；Ampr基因PCR產(chǎn)物稍大于750 bp，符合Ampr基因856 bp的大小.

2.2 pde基因的敲除及克隆

根據(jù)1.3.2.1所述方法構(gòu)建pde′基因.pde基因、Ampr基因酶切及連接前后電泳圖譜，pde′基因、質(zhì)粒pHSG398酶切前后電泳圖譜，以及重組質(zhì)粒pde′-pHSG398電泳圖譜如圖3、圖4、圖5所示.由電泳圖譜可知，pde基因、Ampr基因進(jìn)行了正確切割及連接，重組質(zhì)粒pde′-pHSG398也進(jìn)行了正確構(gòu)建.

圖3 pde基因、Ampr基因酶切前后電泳圖譜

圖4 pde基因、Ampr基因重組前后電泳圖譜

圖5 pde′基因、pHSG398重組前后電泳圖譜

2.3 PDE-重組細(xì)胞的構(gòu)建及篩選

根據(jù)1.3.2.2所述方法，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建PDE-重組細(xì)胞.利用氨芐青霉素培養(yǎng)基及氯霉素培養(yǎng)基篩選目的重組細(xì)胞，共篩選得到30株P(guān)DE-重組細(xì)胞.

由于DNA發(fā)生同源重組時，同時發(fā)生雙交換和單交換，僅發(fā)生單交換時，重組細(xì)胞基因組中不僅含有pde′基因，還含有宿主細(xì)胞的pde基因，因此需篩選發(fā)生雙交換的轉(zhuǎn)化子.雙交換的轉(zhuǎn)化子具有Ampr和Clms，因此篩選指標(biāo)為在加有氨芐抗生素的培養(yǎng)基上生長而在加有氯霉素的培養(yǎng)基上不生長的菌落，即為目的重組菌株.

2.4 PDE-重組菌株的發(fā)酵

醋酸桿菌出發(fā)菌株(Q)及PDE-重組菌株(C1～C30)發(fā)酵生產(chǎn)BC產(chǎn)量如表5所示.出發(fā)菌株(Q)及PDE-重組菌株(C9)發(fā)酵產(chǎn)物BC紅外圖譜如圖6、圖7所示.由表5可知，所篩選30株P(guān)DE-重組菌株發(fā)酵產(chǎn)BC與醋酸桿菌出發(fā)菌株相比較，產(chǎn)量均有所提高，最大產(chǎn)率提高了38%，表明pde基因的敲除可提高BC合成酶作用水平，從而提高BC產(chǎn)量.由圖6、圖7可知，PDE-重組菌株(C9)發(fā)酵產(chǎn)物BC膜紅外光譜圖與出發(fā)菌株(Q) 發(fā)酵產(chǎn)物BC膜紅外光譜圖特征吸收峰相似.1 059 cm-1左右處的吸收峰是由碳氧鍵的伸縮振動引起的，是纖維素分子的特征峰.在3 450 cm-1左右處的吸收峰，反映了分子間氫鍵引起的O-H基的伸縮振動.在1 500 cm-1和2 000 cm-1之間的吸收峰是由纖維素4′端的半縮醛基引起的.在1 645 cm-1左右處的吸收峰是由C-H鍵伸縮振動引起的.紅外光譜圖顯示pde基因敲除不影響菌株的BC合成能力.PDE-重組菌株(C1～C30)遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，重組菌株接種于氨芐青霉素培養(yǎng)基及氯霉素培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，仍然具有Ampr和Clms，證明其pde-基因型穩(wěn)定，重組菌株遺傳穩(wěn)定性能良好.

表5 PDE-重組菌株與出發(fā)菌株BC產(chǎn)量的比較

圖6 出發(fā)菌株發(fā)酵BC紅外光譜圖

圖7 PDE-重組菌株(C9)發(fā)酵BC紅外光譜圖

3 結(jié)束語

通過基因敲除技術(shù)能夠敲除醋酸桿菌(Acetobacterxylinum)基因組中pde基因，成功構(gòu)建PDE-菌株，重組菌株具備BC高產(chǎn)能力，且遺傳穩(wěn)定性能良好.本研究為改善細(xì)菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量低、細(xì)菌纖維素生產(chǎn)難以工業(yè)化的現(xiàn)狀奠定了基礎(chǔ).

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