周瓊花，黎入熒，青增濟，呂龍祥，黃鎖義

（1.右江民族醫(yī)學院臨床學院，廣西百色 533000；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530001；3.右江民族醫(yī)學院藥學系，廣西百色 533000）

龍眼葉黃酮的體外抗氧化活性

周瓊花1，黎入熒1，青增濟1，呂龍祥2，3，黃鎖義3，*

（1.右江民族醫(yī)學院臨床學院，廣西百色 533000；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530001；3.右江民族醫(yī)學院藥學系，廣西百色 533000）

摘 要：對龍眼葉黃酮的抗氧化作用進行研究。以95%乙醇為溶劑，水浴回流提取龍眼葉中的黃酮；采用比色法測定龍眼葉黃酮對DPPH·、O2-·和·OH三種自由基的清除作用以及還原能力。龍眼葉黃酮對三種自由基都有明顯的清除作用，清除能力為DPPH·＞·OH＞O2-·；對Fe3+也具有較強的還原能力。清除率與濃度存在明顯的量效關(guān)系，當黃酮濃度為0.07mg/L時，其清除率O2-·為16.5%，DPPH·為58.8%，·OH為52.5%；還原Fe3+能力隨黃酮的濃度增加而增強。

關(guān)鍵詞：龍眼葉；黃酮；抗氧化

黃酮類（flavontes）化合物是植物光合作用產(chǎn)生的一大類化合物，其藥用價值很高，具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑制抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用[1-2]?，F(xiàn)代研究表明[3]，由于氧化損傷的機制在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，因此，重要的抗氧化作用是使其達到治療效果的重要因素。很多疾病包括腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆等都不同程度地與自由基損害有關(guān)。而黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強的一類天然化合物，由于它具有很強的抑制活性氧、清除自由基作用，同時毒副作用相對小于化學合成藥，在食品中它們應用于功能性食品添加劑和功能食品。因此，黃酮類化合物一直是人們致力于尋找新藥的重要研究領(lǐng)域。

龍眼（Dimocarpus longan Lour）為無患子科龍眼屬常綠果樹，喬木。龍眼的果實俗名桂圓，又名龍目、比目、荔枝奴、益智、亞荔枝、圓眼、川彈子、驪珠、燕卵、蜜脾、鮫淚、木彈、秀木團等[4]，為我國著名的亞熱帶水果。龍眼原產(chǎn)于我國南部和越南北部的南亞熱帶區(qū)域，在我國已有2000多年栽培歷史，是重要的南亞熱帶常綠長壽果樹，為四大嶺南佳果之一。其主要化學成分為葡萄糖苷、谷甾醇、豆甾醇等，我國福建、廣東、廣西及臺灣等省區(qū)為主要生產(chǎn)區(qū)，海南、云南、四川和貴州等省也有種植[6]。

李時珍在《本草綱目》中說：“食品以荔枝為貴，而資益以龍眼為良?！饼堁鄣臓I養(yǎng)價值很高，是南方著名佳果之一。龍眼還是重要的藥材，蘇頌撰寫的《圖經(jīng)本草》，說龍眼“甘平無毒，主治五臟邪氣，安志壓食，久服強魄聰明，輕身不老，通神明”。李時珍的《本草綱目》也說龍眼有“開胃健脾，補虛益智”的功效。龍眼肉可以治療虛勞羸弱，失眠健忘，驚悸怔仲、以及脾虛泄瀉，產(chǎn)后浮腫等癥。此外，龍眼葉、龍眼殼、龍眼花和龍眼皮、根均可以作為配伍的中藥[6]。龍眼葉因為得不到合理的利用，每年都有大量的白白地浪費。龍眼葉中含有大量的生物堿及其他重要成分，對中藥事業(yè)的研究開發(fā)具有重要價值[7]。本文報道龍眼葉總黃酮對DPPH·、O2-·和·OH自由基的清除作用以及還原Fe3+能力。

1 儀器與材料

722N可見分光光度計：上海精科；ZKJ-1002循環(huán)水式真空抽氣泵：上海嘉鵬科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA：上海安亭實驗儀器有限公司；HH-SA數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海上登實驗設(shè)備有限公司；DPPH：美國Sigma公司；龍眼葉：采摘于右江民族醫(yī)學院校內(nèi)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的提取

取烘干的龍眼葉，粉碎至粉末。稱取龍眼葉粉末約6 g加80 mL95%乙醇，水浴回流提取2.5 h，抽濾。濾渣再加80 mL95%乙醇，水浴回流提取2.5 h，抽濾，合并兩次濾液減壓回收乙醇至濾液僅剩5 mL～7 mL左右為止，放置100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得樣品液。

2.2 黃酮的含量測定

龍眼葉黃酮含量測定[8]：分別精密吸取黃酮提取液0.5 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑空白作參比液，于510 nm處測吸光度A。A=0.635，根據(jù)回歸方程：A=-14.46C-2.230×10-2，計算樣品中總黃酮的含量ρ=0.909 0 mg/mL。

2.3 黃酮提取物清除DPPH自由基能力

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應，提供H被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色，可以用紫外可見分光度法定量測定。取0.5 mL新配置的 DPPH 溶液[c（DPPH）=6×10-4mol/L]置于 10 mL的具塞比色管中，然后加入不同體積的樣品溶液，無水乙醇定容至5 mL，室溫暗光下反應30 min，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm處測定其吸光度A。以高濃度逐漸稀釋的方式檢測不同濃度樣品對自由基的清除率，以自由基清除率為50%時樣品的濃度（IC50）來衡量樣品對自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強。其清除率計算公式：

清除率（%）=[（A1-A2）/A1]×100%

式中：A1為反應時間t=0 min時空白吸光度；A2為反應時間t=30 min時的吸光度。

以試驗提取液總黃酮作為樣品用無水乙醇定容至5 mL分別測其對DPPH自由基清除的作用結(jié)果見圖1。

圖1 DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radicals clearance

由圖1可以看出，隨著黃酮濃度的增加，對DPPH的清除作用增大，自由基清除率為50%時樣品的濃度（IC50）為0.052 mg/L，濃度較小，表明龍眼葉黃酮清除DPPH自由基的能力較顯著。

2.4 黃酮提取物清除超氧自由基能力

采用鄰苯三酚自氧化法進行測定。具體方法如下：取0.5 mol/L、pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.0 mL于干燥具塞比色管中，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入不同濃度的待測品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L鄰苯三酚（由10 mmol/L HCl制）0.8 mL，混勻后25℃水浴中準確反應4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2滴終止反應，蒸餾水調(diào)零，在320 nm處測定吸光度A。其清除率計算公式：

式中：A0為加鄰苯三酚但不加樣品時的吸光度；A1為加樣品和鄰苯三酚時的吸光度；A2為加樣品不加鄰苯三酚時的吸光度。

超氧自由基清除率見圖2。

從圖2中可以看出，龍眼葉總黃酮提取液對O2-·有一定的清除作用，隨著龍眼葉總黃酮提取液濃度的增加，對O2-·自由基的清除能力也增強，說明當黃酮類物質(zhì)的濃度增加時，其清除率也增大。

圖2 超氧自由基清除率Fig.2 Clearance rate of superoxide redical

2.5 黃酮提取物清除·OH自由基能力

參照Fenton反應的方法建立反應體系模型[9]，利用H2O2與Fe2+反應產(chǎn)生·OH，由于·OH具有很高的反應活性，存活時間短，若在反應體系中加入水楊酸，就能有效地與·OH結(jié)合，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。反應是如下：H2O2+Fe2+→ Fe3++·OH+OH-

該產(chǎn)物在510 nm處有強吸收，若在此反應體系中加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色參物生成量減少，采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系（8.8 mmol/LH2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液 1 mL）加入一系列不同濃度的樣品溶液，并以蒸餾水為參比，與試劑空白液為比較，在510 nm處測量各濃度下的吸光度，便能測定被測物（總黃酮）對·OH的清除作用，其清除率計算公式：

清除率（%）=[（A0-AΧ）/A0]×100%

本試驗以提取液總黃酮作為樣品，分別取不同體積的樣品定容到10 mL分別測其對·OH的清除作用。結(jié)果見圖3。

圖3 ·OH自由基清除率Fig.3 Clearance rate of·OH radicals

從圖3中可看出，隨著黃酮濃度的增加，對·OH自由基的清除能力也增強。

2.6 還原Fe3+能力

采用普魯士蘭法測定樣品還原Fe3+能力。在系列10 mL具塞比色管中依次加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL，2.5 mL磷酸鹽緩沖液 [C（磷酸鹽緩沖液）=0.2 mol/L pH6.6]和2.5 mL鐵氰化鉀（1%），混勻后置于50℃水浴中反應20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%），混勻后將溶液渾濁離心（3 000 r/min）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL（0.1%）三氯化鐵溶液，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm處測定吸光度值，吸光度值增加表明還原能力增強。

表1 還原Fe3+能力吸光度值Table 1 Reduction Fe3+ability absorbency value

由表1可以看出，隨著黃酮濃度增大，其吸光度值增加，對Fe3+還原能力增強。

2.7 三種自由基清除率的比較

龍眼葉黃酮對三種自由基都有明顯的清除作用，如圖4所示。

圖4 對DPPH·、O2-·和·OH三種自由基清除率的比較Fig.4 Comparison of DPPH·，O2-·，·OH radicals clearance rate among the three

對自由基的清除能力強弱是：DPPH·＞·OH ＞ O2-·。

3 結(jié)論

本研究表明，龍眼葉黃酮對DPPH·、O2-·和·OH三種均具有較好的清除作用，而且對自由基的清除作用隨著黃酮液濃度的增加而增強。當黃酮的濃度為0.07 mg/L時，其清除率O2-·為16.5%，DPPH·為58.8%，·OH為52.5%；對金屬Fe3+還原能力隨黃酮的濃度增加而增強。因此，龍眼葉黃酮具有較強的抗氧化活。

近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點備受青睞，而黃酮類化合物以其光譜的藥理作用引人矚目。我國龍眼葉資源非常豐富，因此，龍眼葉黃酮所具有的抗氧化活性使其有望作為天然抗氧化劑和功能性產(chǎn)品而得到開發(fā)利用，有良好的開發(fā)價值和利用前景。同時，為今后對黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)修飾和合成、發(fā)現(xiàn)先導化合物提供理論依據(jù)和重要的參考意義[10]，這必將對新藥的產(chǎn)生、新抗氧化劑的開發(fā)、應用及研究產(chǎn)生較大的影響。

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Antioxidant Effect of the Flavanone in the Longan Leaves

ZHOU Qiong-hua1，LI Ru-ying1，QING Zeng-ji1， Lü Long-xiang2，3，HUANG Suo-yi3，*
（1.School of Clinical Medicine，Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000，Guangxi， China；2.Faculty of Pharmacy，Guangxi Traditional Medical University， Nanning 530001， Guangxi， China；3.Department of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000， Guangxi， China）

Abstract：Study on the antioxidant of the flavanone in the Longan leaves.The flavonoids were extracted with w（Ethanol） =95%as the solvent from Longan leaves by water bath backflow.It will determine the flagstone's scavenging process acting on DPPH·，·OH and O2-·with the Spectrophotometry， and the reduction of Fe3+ability.Total flavanone from Longan leaves have significant scavenging effect to three kinds of free radicals，the result of scavenging process is that DPPH·＞·OH ＞ O2-·；moreover it also have strong ability of reduction to Fe3+.Clearance and concentration obvious concentration-response relationship.When the content of the total flavanone of Longan leaves was ρ（Flavanone）=0.07 mg/L，the clearance rate of DPPH·，·OH and O2-·was 58.8%，52.5%and 16.5%.Evident reduction energy of the flavanone was increasing by the concentration.

Key words：Longan leaves；flavanone；anti-oxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.005

周瓊花（1991—），女（漢），本科，研究方向：天然產(chǎn)物化學、藥物化學。

黃鎖義（1964—），男（漢），教授，碩士研究生導師，研究方向：天然產(chǎn)物化學、藥物化學、食品衛(wèi)生、中草藥與植物化學。

2012-08-19