夏 君 綜述 謝 炯 張 萍 審校

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 熱帶病教育部重點實驗室，廣州510080)

病毒感染后，細(xì)胞合成分泌大量的干擾素(Interferon，IFN)，這些IFN通過自分泌或旁分泌的方式與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活STAT/JAK信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控300多個干擾素調(diào)控基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，其中包括經(jīng)典的抗病毒蛋白PKR。PKR即雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。dsRNA可以激活PKR，使其發(fā)生自我磷酸化，而活化的PKR進(jìn)一步促進(jìn)IFN的產(chǎn)生，也可以協(xié)同參與其他抗病毒機(jī)制，在固有免疫信號通路中發(fā)揮重要作用[1]。本文綜述了近年來在PKR的結(jié)構(gòu)，激活因素，功能以及與疾病關(guān)系等方面的研究進(jìn)展。

1 PKR的結(jié)構(gòu)

PKR基因定位于人染色體2P21-22，在鼠中定位于染色體17E2上。人的PKR由551個氨基酸組成，鼠的PKR是由515個氨基酸組成。雖然不同哺乳動物PKR的分子量和氨基酸序列存在一定的差異，但它們的分子結(jié)構(gòu)是相似的。以人PKR蛋白結(jié)構(gòu)為例，N端為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，有2個串聯(lián)分布的dsRNA結(jié)合基序 dsRNA-binding motifs1(dsRBM1)和dsRNA-binding motifs2(dsRBM2)，分別位于 55～75aa及145～166aa區(qū)域內(nèi)，dsRBM1和dsRBM2均有相似的αβββα折疊形成的模體，N端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)PKR同dsRNA的結(jié)合。C端為催化結(jié)構(gòu)域，含有11個保守的激酶亞結(jié)構(gòu)域，aa273到羧基末端的aa551這一區(qū)域是ATP結(jié)合區(qū)域，其中aa296位點是賴氨酸，在磷酸化反應(yīng)時接收ATP。C端的催化基團(tuán)主要是激酶區(qū)介導(dǎo)激活后的一些級聯(lián)反應(yīng)，如 eIF-2 α磷酸化導(dǎo)致蛋白合成終止等[1]。PKR與其經(jīng)典的底物蛋白起始因子eIF-2 α相互作用的區(qū)域位于367～551aa，eIF-2 α與該區(qū)域的αG螺旋結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變使可使需要磷酸化的基團(tuán)更加接近PKR C端ATP結(jié)合區(qū)域，有利于磷酸化的進(jìn)行。

PKR在細(xì)胞中的存在形式至少有以下三種:無活性單體，在胞質(zhì)的無活性二聚體和呈“鐘形”卷曲的活性二聚體。PKR無活性構(gòu)象的維持主要是依賴N端的dsRNA結(jié)合區(qū)域(dsRBD)和激酶區(qū)的PACT 結(jié)合區(qū)域(PBM)的相互作用[2]。

2 PKR的激活

PKR在細(xì)胞中一般不具有激酶活性，只有在活化物刺激活化后才能發(fā)揮作用，常見的PKR活化物包括 dsRNA、TLR配體、PACT蛋白以及細(xì)胞因子等。

2.1 RNA PKR的dsRBD能夠與病毒復(fù)制產(chǎn)生的及人工合成的dsRNA相互結(jié)合。dsRBD與dsRNA以最適方式結(jié)合，使dsRBD從激酶區(qū)域解離開來，激酶區(qū)被活化[3]。研究發(fā)現(xiàn)小劑量的dsRNA促進(jìn)PKR的二聚化和活化，大劑量的dsRNA反而無法激活PKR，通過dsRBD和dsRNA之間化學(xué)計量實驗顯示dsRNA與PKR是近似一對二的作用模式[4]，兩個dsRBD即4個dsRBM，可以通過首尾相接包裹一個長的dsRNA。dsRNA的作用是將PKR單體聚攏，使激酶區(qū)接近來增強二聚化，誘導(dǎo)自身磷酸化。

dsRNA的長度也決定了PKR可否被活化，通常30 bp以上的dsRNA可使PKR活化，有研究報道24 bp和33 bp的dsRNA可以競爭性抑制79 bp的長鏈dsRNA對PKR的激活[5]，但過長的dsRNA非但不能活化反而抑制了 PKR的活性，85 bp為最適長度[3，6]。除了長度以外，RNA的結(jié)構(gòu)與PKR激活也有密切的關(guān)系。目前認(rèn)為，可激活PKR的RNA無序列特異性，除了經(jīng)典的dsRNA外，含有凸出結(jié)構(gòu)(Bulges)、內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)(Internal loops)或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)的RNA均可激活PKR。通過特殊結(jié)構(gòu)dsRNA庫(Partially structured dsRNA library)循環(huán)搜索與PKR配對的RNA發(fā)現(xiàn)，庫中與PKR dsRDM配對的區(qū)域都是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈dsRNA(Aptamers)，且這些短鏈dsRNA與dsRBM結(jié)合的莖結(jié)構(gòu)兩端都帶有單鏈尾，單鏈尾的長度對于PKR的激活起到重要的作用，至少需要6個核苷酸才能激活，9個核苷酸是最適長度[5]。siRNA作為一類特殊的RNA在干擾素系統(tǒng)中被廣泛研究，有研究顯示PKR可以被合成的大小為21 bp的siRNA激活，進(jìn)而參與干擾素系統(tǒng)的調(diào)控，這與認(rèn)為小于33 bp的短鏈RNA無法激活PKR的觀點相反，可能是由于合成的短鏈siRNA折疊方式不一樣[5，7]。研究顯示，轉(zhuǎn)染抑制乙型肝炎病毒的siRNA并不影響PKR的活化情況，這說明siRNA對PKR的激活除了結(jié)構(gòu)和長度的因素外，可能還存在其他因素使它不影響PKR的活化且能夠發(fā)揮抑制病毒翻譯的功能。

綜上所述，對于調(diào)控PKR的RNA除了長短和結(jié)構(gòu)之外，RNA的類型可能也是影響因素之一，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

2.2 TLR(Toll-like receptor)配體 TLRs即 Toll樣受體家族，包括TLR1～TLR11。TLRs在固有免疫中有重要的作用，可識別多種微生物的病原分子相關(guān)模式(PAMPs)，例如:TLR2識別革蘭陽性菌的肽聚糖;TLR4可以識別革蘭陰性菌的脂多糖(LPS);TLR3可以識別病毒的dsRNA等。TLR蛋白通過LRR(亮氨酸重復(fù)序列)與配體結(jié)合后激活下游信號分子JNK、P38、IRF-3等啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒作用。PKR可被LPS刺激的TLR4所活化，實驗證實PKR敲除的小鼠細(xì)胞在LPS刺激后無法產(chǎn)生抗炎因子，提示PKR介導(dǎo)了TLR4誘導(dǎo)的信號通路[8]。最近發(fā)現(xiàn)，LPS刺激的內(nèi)毒素耐受的巨噬細(xì)胞中PKR的磷酸化水平和PKR蛋白總量都下降，而用蛋白酶體抑制劑MG132能使這種現(xiàn)象得到回復(fù)。這說明耐受細(xì)胞中部分PKR會被蛋白酶體降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PKR是同SOCS-1相互作用后被K48 Ub泛素化，進(jìn)而通過蛋白酶體降解的[9]。TRAF家族作為TLR受體的下游分子，在免疫調(diào)節(jié)和激活NF-κB通路中發(fā)揮重要的作用。研究表明PKR C端(266aa～551aa)激酶區(qū)和TRAF5 C端(345aa～558aa)的TRAF domain存在相互作用，且只有PKR的二聚體活化形式才能聚集TRAF5并進(jìn)一步激活 NF-κB 通路[10]。由此可見，PKR 與TLR在固有免疫應(yīng)答中存在復(fù)雜的聯(lián)系。

2.3 PACT(The protein activator of PKR)蛋白PACT是一種人源細(xì)胞蛋白，小鼠的同源蛋白稱為RAX。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，PACT介導(dǎo)PKR的活化并不依賴 dsRNA[11]。在病毒感染的細(xì)胞中PACT將dsRNA募集至PKR，同時，具有在多種生長分化條件下調(diào)理細(xì)胞內(nèi)PKR活性的潛力。PACT含有三個獨立的區(qū)域，前兩個同dsRBM類似，PACT domain 1和PACT domain 2能夠促進(jìn)PKR和PACT緊密結(jié)合。后一個PACT結(jié)構(gòu)域(PACT domain 3)則是一個含66個氨基酸的區(qū)域，它與PKR結(jié)合不緊密但卻是活化PKR所必需。PACT domain3與PKR激酶區(qū)的PBM基序結(jié)合使PKR從無活性結(jié)構(gòu)中釋放出來。通過定點突變研究，發(fā)現(xiàn) PKR的aa328和aa335殘基是PACT domain3結(jié)合的必需位點[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PKR上的 PBM328位和333位氨基酸是其與dsRBD結(jié)合的重要位點，若將這兩個位點的天冬氨酸殘基置換成甘氨酸，PKR在沒有激活劑的情況下表現(xiàn)為持續(xù)性激活。且用一段結(jié)構(gòu)類似PBM誘導(dǎo)肽，即與PKR 326-337aa相同基序的短肽，能通過競爭結(jié)合dsRBM2干擾dsRBM2與PBM的相互作用來活化PKR[2]。

2.4 細(xì)胞因子 研究證實PKR能夠參與一些由細(xì)胞因子如 IFN、PDGF、TNF-α、IL等激活的信號通路。IFN是PKR經(jīng)典的誘導(dǎo)劑;PDGF可誘使PKR活化，使早期即刻基因C-fos表達(dá)[11]。

3 PKR的功能

3.1 抑制病毒復(fù)制 最早發(fā)現(xiàn)的PKR功能是其具有抑制病毒復(fù)制的活性。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA與PKR的N端dsRBM結(jié)合，并激活PKR，PKR C端激酶區(qū)與底物蛋白eIF-2 α相結(jié)合，使其51位的絲氨酸磷酸化。eIF-2 α為細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯起始的重要調(diào)節(jié)因子，eIF-2 α磷酸化可導(dǎo)致病毒或宿主mRNA進(jìn)入核糖體形成起始復(fù)合物的過程受阻，從而抑制細(xì)胞和病毒的蛋白質(zhì)合成[11]。研究發(fā)現(xiàn)病毒為逃逸PKR的抗病毒作用，例如:流感病毒主要通過兩條途徑來逃避PKR的抗病毒作用，一是病毒使胞內(nèi)蛋白P58IPK聚合從而抑制PKR的激酶活性，另一條是通過病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1直接或間接作用阻止PKR的活化，用突變NS1的病毒株感染PKR敲除的小鼠和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)后者的病毒滴度明顯低于前者，證明NS1能通過抑制PKR通路來幫助病毒復(fù)制[12，13]。

3.2 參與多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)

3.2.1 STAT1(Signal transducer and activator of transcription)信號通路 STAT蛋白是胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其家族有眾多成員，包括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6等。STAT作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，能介導(dǎo)多種生物功能。大部分細(xì)胞因子，如生長激素、IFN、G-CSF等可以通過作用于細(xì)胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶JAKs，激活STAT從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。

在鼠和人細(xì)胞中，STAT1、STAT3與PKR均有相互作用，在PKR Δ6(PKR主要活性區(qū)域都失活)突變細(xì)胞中，STAT1與DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活受阻，證明PKR在STAT1的轉(zhuǎn)錄過程具有重要作用，且PKR與STAT1的作用是依賴于PKR RNA結(jié)合區(qū)的。PKR在介導(dǎo) STAT3的磷酸化(Tyr705和Ser727)過程中扮演了非常重要的角色，進(jìn)一步的研究表明，PKR同STAT3的作用是間接的，STAT3并不是PKR的直接底物[14]。

有文獻(xiàn)顯示，STAT是PKR抗病毒通路的一個重要分支，它作為下游分子參與了PKR的抗病毒作用[13]。

3.2.2 MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信號通路 MAPK具有絲/蘇氨酸催化活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生物功能，MAPK分為ERK，P38，JNK等多個家族。PKR作為一種應(yīng)激蛋白活化激酶，能夠介導(dǎo)JNK和P38活化，在IFN-γ、IL-1等細(xì)胞因子作用下，P38和JNK活化是依賴PKR的。最近研究發(fā)現(xiàn)，在PKR沉默的細(xì)胞系中，病毒感染后MAPK的活化受到抑制，同樣用dsRNA刺激這類細(xì)胞，MAPK活化也受到抑制，證明PKR對MAPK的活化起關(guān)鍵作用。突變PKR的激酶活性區(qū)，抑制了p38和JNK的活化，證明 p38和 JNK活化與PKR的激酶區(qū)有關(guān)[15]。有些研究發(fā)現(xiàn)PKR是MAPKs途徑的上游調(diào)控分子，然而在UV誘導(dǎo)多種細(xì)胞(JB6C141細(xì)胞，GM09621XIBAO，MEFs)，發(fā)現(xiàn)ERK和ERK下游的RSK2可以引起PKR和eIF-2 α磷酸化從而介導(dǎo)細(xì)胞損傷甚至癌變[16]。

因此，MAPK和PKR之間的關(guān)系復(fù)雜多樣，在細(xì)胞多個生物學(xué)活動中占有重要位置。

3.2.3 NF-κB信號通路 NF-κB是廣泛存在于各類細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與了各種細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)，如免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和抗凋亡等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB以同源二聚體或異源二聚體的形式存在，通常由I κ-B抑制其活性，NF-κB經(jīng)典的激活途徑是固有免疫所必需的。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)大量表達(dá)PKR時，IKK活性增高，導(dǎo)致 IKK β蛋白磷酸化增多，解除了其對 NF-κB的抑制作用，NF-κB活化后進(jìn)入胞核促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的發(fā)生[17]。而利用PKR敲除細(xì)胞實驗表明，NF-κB的活化并不完全依賴于PKR，用dsRNA刺激仍然可以激活NF-κB，說明NF-κB可以被PKR依賴與非依賴的多種信號通路所激活[18]。PKR 底物 eIF-2 α在 NF-κB 誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，突變eIF-2 α后NF-κB誘導(dǎo)的凋亡明顯減少[19]，說明 eIF-2 α除了抑制翻譯，也參與了其他細(xì)胞活動的調(diào)控，具體的分子機(jī)制需待進(jìn)一步探究。

3.3 PKR與凋亡的關(guān)系 PKR的另一個重要功能是參與了對細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在PKR敲除小鼠的MEF細(xì)胞中，dsRNA、TNF-α、LPS等誘導(dǎo)凋亡受到了顯著的抑制。研究表明PKR敲除直接抑制了Fas mRNA的表達(dá)，從而抑制了Fas誘導(dǎo)的凋亡通路。PKR通過激活FAS通路，來激活下游的Caspase-8誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，F(xiàn)ADD-/-的細(xì)胞可以抵抗dsRNA誘導(dǎo)的凋亡，而TNF-α誘導(dǎo)PKR敲除的細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn) Caspase-8 mRNA 下調(diào)[20]。

研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞凋亡的早期，PKR被水解、活化并伴隨eIF-2 α磷酸化。在anti-Fas受體誘導(dǎo)的U937細(xì)胞凋亡過程中，PKR被水解成為N端38 kD和激酶端43 kD的兩個片段;與此同時，eIF-2 α磷酸化增多，且從35 kD水解成32 kD。進(jìn)一步研究證實caspase-3、caspase-7、caspase-8 能在 Asp125 處水解PKR，而 caspase-1和 caspase-11則無法水解PKR[21]。近年也有報道，PKR可以通過非Fas依賴途徑誘導(dǎo)caspase-8的激活從而誘導(dǎo)凋亡?？傊琍KR在凋亡途徑中具有重要的調(diào)控作用，它可以多途徑，多方式誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生[22]。

4 PKR與其他RNA活性相關(guān)蛋白

除PKR外，與dsRNA相互作用的細(xì)胞蛋白還有Toll樣受體家族(主要TLR3和TLR7)、RIG-I和MDA5[23]。RIG-I主要識別5'端三磷酸修飾的 RNA和非己的帶有短鏈dsRNA結(jié)構(gòu)或多聚尿苷修飾的RNA，還可識別正鏈和負(fù)鏈病毒RNA。MDA5則識別結(jié)合穩(wěn)定的長鏈dsRNA結(jié)構(gòu)，且特異性識別小核糖核酸病毒和病毒的模擬物PolyI:C。TLR3主要識別病毒dsRNA以及PolyI:C，TLR7則識別病毒的單鏈RNA。在PolyI:C刺激后，這些RNA結(jié)合蛋白可調(diào)控不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮不同的功能。TLR3主要是通過活化NF-κB通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，同時活化IRF3信號通路促使IFN的表達(dá)。RIG-I和MDA5主要通過 TBK-1活化 IRF3誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，對于NF-κB通路的作用則非常微弱。有趣的是，PKR活性的抑制均可明顯阻斷IRF3和NF-κB信號通路[23]。

RIG-I、MDA5可誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生，在抗病毒效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。如在分別沉默RIG-I和MDA5的細(xì)胞中，輪狀病毒感染后IFN下降不明顯，而同時沉默 RIG-I和 MDA5后，輪狀病毒誘導(dǎo)的IFN明顯下降，PKR對輪狀病毒誘導(dǎo)的IFN的作用可能主要發(fā)揮在IFN的分泌階段，PKR促進(jìn)IFN的分泌[24]。因此，這些RNA活化相關(guān)蛋白通過不同途徑(主要是NF-κB和IRF3通路)，在不同的環(huán)節(jié)相互協(xié)同以發(fā)揮抗病毒作用。

5 PKR與疾病

隨著醫(yī)學(xué)日益發(fā)展，腫瘤已成為研究的焦點，凋亡則是抗腫瘤的一種重要途徑。由于PKR和凋亡的關(guān)系密切，所以普遍認(rèn)為PKR在腫瘤中也會起到一定的作用。目前，PKR在腫瘤細(xì)胞中的作用結(jié)果不一，一般認(rèn)為PKR可以抑制腫瘤。抑制的機(jī)理可能是通過TNF-α啟動caspase通路使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;而在分化良好的腫瘤中，PKR的高表達(dá)可降低細(xì)胞增殖。有研究證明，p53能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生PKR，p53敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞中PKR和其他一些目的基因的表達(dá)明顯下降，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p53直接作用于PKR的啟動子，PKR在輔助p53抑制腫瘤生長中起了一定的作用，PKR敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞變小且增殖速度加快，這與p53敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)類似[25]。

另有一些研究不支持PKR在腫瘤中的抑制學(xué)說，相反，提出了PKR促腫瘤生長作用理論。一個實驗證據(jù)是，PKR敲除的小鼠也并未為發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生率有所增加。另外，PKR在正常細(xì)胞(NHBES和HMECS)的表達(dá)水平明顯低于癌細(xì)胞(A549，PC3)，在沉默PKR的A549和PC3癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增多[26]。PKR誘導(dǎo)凋亡與在癌細(xì)胞中的作用方式仍有待進(jìn)一步的明確。

PKR在腫瘤預(yù)后判斷方面也有一定的應(yīng)用。臨床資料表明，非小細(xì)胞肺癌患者中，癌細(xì)胞磷酸化型PKR和eIF-2 α較多者存活時間較長，可能作為對Ⅰ、Ⅱ級癌癥患者預(yù)后評估的指標(biāo)之一[27]。

除了腫瘤，PKR還與其它許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在代謝性疾病糖尿病研究中，高脂飲食野生型小鼠易發(fā)展成為肥胖小鼠，出現(xiàn)高胰島素血癥，而PKR敲除的小鼠中血清瘦素水平低于野生型小鼠，不易發(fā)展為肥胖小鼠，提示PKR敲除小鼠對胰島素敏感性增強，推測PKR直接靶向調(diào)節(jié)胰島素受體，增強營養(yǎng)物和胰島素的作用，為糖尿病治療提供新的思路[28]。PKR 在神經(jīng)疾病 Alzheimer's disease(AD)中，可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在AD患者的腦脊液中磷酸化PKR(pPKR)及其與PKR總量的比值均增高，且 pPKR的特異性高達(dá) 94.3%，靈敏度為91.1%[29]。這預(yù)示pPKR可能成為檢測AD新的生物標(biāo)志。

6 結(jié)語

PKR在抗病毒免疫中發(fā)揮了雙重作用，一方面，PKR通過其dsRBD結(jié)合dsRNA后激活，調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答信號通路來影響固有免疫的強度;另一方面，PKR又可作為固有免疫應(yīng)答的一個效應(yīng)蛋白，直接干擾了病毒蛋白的翻譯。因此，深入研究PKR與其調(diào)控病毒感染引起的免疫調(diào)控機(jī)制，以及闡明病毒是如何拮抗PKR效應(yīng)的機(jī)理，無疑將對抗病毒感染疾病的預(yù)防和治療提供新的策略。另外，PKR在其它疾病中的功能尚不明確，進(jìn)一步研究PKR激活的意義和功能，可以為這些疾病的診斷和防治提供新的線索或治療靶點。

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