揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 徐 俊 侯玉潔 史仁煌＊ 劉 紅 楊宏波 趙國(guó)琦

中國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì) 丁健

揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng) 朱建明

上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司 蘇衍菁

牧草對(duì)反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)必不可少，其經(jīng)瘤胃發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸可為反芻動(dòng)物提供70%～80%的能量，牧草纖維還對(duì)維持腸道健康和發(fā)揮最大生產(chǎn)潛力具有重要作用。然而，粗飼料在瘤胃中的降解率是決定其飼喂價(jià)值的關(guān)鍵因素（Sun，2006）。 植物形態(tài)、 結(jié)構(gòu) （Wilson和 Hatifield，1997）、 細(xì)胞壁組分 （Sun，2006）， 動(dòng)物咀嚼行為（Pan 等，2003）和瘤胃內(nèi)環(huán)境（Miron 等，2001）等因素均會(huì)影響牧草纖維的消化。研究表明，提高粗飼料降解率不但可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，還能減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流向環(huán)境造成浪費(fèi)和污染 （Jung等，2011）。纖維的降解依賴于瘤胃內(nèi)棲息的大量微生物，包括細(xì)菌、真菌和原蟲等（Dijkstra和Tamminga，1995），它們共同作用將牧草纖維逐漸降解。本文主要介紹了瘤胃微生物對(duì)牧草的降解及影響纖維降解的因素。

1 瘤胃微生物對(duì)牧草纖維的降解

奶牛采食的粗飼料先經(jīng)咀嚼和反芻作用將粗飼料變短，然后經(jīng)瘤胃微生物進(jìn)一步降解，微生物的降解作用是決定粗飼料降解率高低的關(guān)鍵因素。瘤胃中微生物主要包括細(xì)菌、真菌和原蟲，細(xì)胞壁降解的80%由瘤胃中細(xì)菌和真菌完成，原蟲的作用僅占 20%（Sun等，2007）。

1.1 細(xì)菌對(duì)牧草纖維的降解 在瘤胃中，黃色瘤胃球菌（R.flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（F.succinogenes）是公認(rèn)的分解纖維的三種優(yōu)勢(shì)菌，它們對(duì)植物細(xì)胞壁的降解作用已通過(guò)電子顯微鏡觀察得到了充分證實(shí)（Jung 和 Engels，2001）。 瘤胃中 88%～91%的葡糖糖內(nèi)切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶是由飼料顆粒中緊密吸附的微生物分泌（Koike 等，2003），因此，與飼料顆粒緊密吸附的細(xì)菌對(duì)纖維的降解起主要作用（Miron等，2001）。

瘤胃細(xì)菌對(duì)飼料顆粒的吸附和降解作用因牧草種類而不同（Sun，2006；Akin，1989）。 以黑麥草為研究材料的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可快速吸附于黑麥草上，15 min后細(xì)菌總數(shù)可達(dá)峰值（Edwards，2007）。黃色瘤胃球菌主要定植于黑麥草的表皮、薄壁組織和韌皮部邊緣（Latham等，1978）。以羊茅草和鴨茅草為研究材料的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，羊茅草葉中不同組織部位的降解率不同，葉肉細(xì)胞和韌皮部纖維要比外周維管束鞘和表皮組織優(yōu)先降解，表皮和薄壁組織可完全被降解，植物組織類型的不同會(huì)改變微生物吸附的種類和數(shù)量，黃色瘤胃球菌不易附著在葉肉組織細(xì)胞和木質(zhì)部導(dǎo)管中（Sun等，2007），此外，羊茅草中纖維分解菌有70%是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌（Cheng等，1984），它們可占細(xì)菌總數(shù)的0.1%～6.6%和 1.3%～2.9%（Krause 等，1999）。Shinkai和Kobayashi（2007）通過(guò)熒光原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌對(duì)鴨茅草的定植作用，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌可緊密吸附于橫斷面邊緣及未降解的內(nèi)部組織，黃色瘤胃球菌要比產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌更傾向于吸附在葉鞘組織中，黃色瘤胃球菌對(duì)鴨茅草的降解起主導(dǎo)作用，其在瘤胃中的數(shù)量更多且降解莖桿的能力更強(qiáng)。Koike等（2003）通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性PCR和尼龍袋法研究了綿羊中三種主要纖維降解菌對(duì)鴨茅莖的吸附和降解情況，結(jié)果表明，三種纖維分解菌的數(shù)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，且在24 h時(shí)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量達(dá)到峰值，分別為109cfu/g干物質(zhì)和107cfu/g干物質(zhì)，而白色瘤胃球菌在48 h達(dá)到峰值，為106cfu/g干物質(zhì)。莖中中性洗滌纖維降解率隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，這與細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢(shì)并非一致，可能是因?yàn)槔w維酶活性滯后造成的。在鴨茅莖桿中吸附的細(xì)菌數(shù)量為產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌>黃色瘤胃球菌>白色瘤胃球菌，這與瘤胃食糜中三種細(xì)菌的數(shù)量相吻合。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃食糜和牧草莖桿降解中最重要的細(xì)菌。

在對(duì)秸稈的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瘤胃中pH為6.0時(shí)，吸附在大麥秸稈中的細(xì)菌量可達(dá)峰值，且黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌吸附量會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，分別為33 mg/g干物質(zhì)和23 mg/g干物質(zhì)，它們?cè)诖篼溄斩捴械奈轿稽c(diǎn)各不相同（Bhat和o/rskov，1990）。而將玉米秸稈機(jī)械破碎后發(fā)現(xiàn)，吸附于玉米秸桿上的纖維素分解菌和半纖維素分解菌的數(shù)量均得到顯著提高，這更有助于秸稈的消化（Kozakai等，2007）。

1.2 真菌對(duì)牧草纖維的降解 真菌可穿透牧草的角質(zhì)層屏障降解無(wú)法被細(xì)菌和原蟲降解的木質(zhì)化組織（Akin，1989），但真菌對(duì)低木質(zhì)化組織的降解能力有限（Hobson 和 Stewart，1997）。 Wilson 和Hatfield（1997）研究指出，真菌可以減弱植物纖維組織的內(nèi)部張力，使其變得疏松而易被瘤胃中微生物降解，雖然瘤胃中真菌遠(yuǎn)不及細(xì)菌多，但是真菌可以優(yōu)先深入到植物纖維組織內(nèi)部促進(jìn)細(xì)菌的進(jìn)一步降解（Varga和Kolver，1997）。真菌可以分泌多種降解植物細(xì)胞壁的酶，其中活性最高的是纖維素酶和木聚糖酶（Sun等，2007）。

瘤胃真菌可降解植物中的大部分多糖，并能溶解植物片段（Akin，1994）。研究發(fā)現(xiàn)，在體外純培養(yǎng)中有40%～45%的麥秸片段干物質(zhì)在4 d內(nèi)消失，而約50%的纖維素和半纖維素被消化，約16%的木質(zhì)素也被損失。瘤胃真菌還有水解蛋白質(zhì)的能力，而纖維分解細(xì)菌則無(wú)此功能，真菌的假根可穿透植物組織的蛋白層，而這一層阻止了纖維菌進(jìn)入細(xì)胞壁（Wallace 和 Joblin，1985）。

Karunanandaa等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，用白腐真菌處理稻草的莖和葉，其體外干物質(zhì)消化率可分別提高13%和30%，真菌處理造成維管束鞘崩裂，使微生物更易接觸而促進(jìn)葉肉組織的消化。Edwards等（2008）研究表明，黑麥草在瘤胃中培養(yǎng)5 min時(shí)即可發(fā)現(xiàn)真菌的存在，樣品處理方法并不會(huì)影響真菌的定植。

1.3 原蟲對(duì)牧草纖維的降解 研究表明，瘤胃中缺乏原蟲時(shí)，細(xì)胞壁在瘤胃中的降解率下降（Williams和 Coleman，1992）， 且在原蟲中發(fā)現(xiàn)有纖維酶的存在（Wang 和 McAllister，2002），因此，原蟲也被認(rèn)為在植物細(xì)胞壁的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用（Sun等，2007）。目前研究最多的分解纖維素的原蟲是真雙毛屬原蟲（Eudiplodinium maggii），單個(gè)蟲體可以吞噬148 ng的纖維素，它的消化速率達(dá)到 320 pg/min（Coleman，1992）。 除了內(nèi)毛屬原蟲（Entodinium spp）以外，在所有內(nèi)毛蟲目（Entodiniomorphid）的原蟲體內(nèi)均含有纖維素酶，且纖維素酶活性最高的原蟲是Eudiplodinium maggii、Epidinium ecaudatum caudatum 和 Ostracodinium obtusum bilobum。然而，由于原蟲在體外很難培養(yǎng)和存活，因此，有關(guān)原蟲對(duì)纖維降解作用的研究受到一定限制，有待于進(jìn)一步深入探討。

2 影響纖維消化的因素

2.1 動(dòng)物采食、日糧處理和飼喂方式 動(dòng)物采食、日糧處理、飼喂方式等均會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和底物纖維的消化（Varga和Kolver，1997）。動(dòng)物采食會(huì)影響瘤胃液和內(nèi)容物的周轉(zhuǎn)速率，而結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解速率與食糜流通速率有關(guān)，且隨動(dòng)物采食量的提高而降低 （Russell等，1992）。將粗飼料粉碎和制粒后，纖維素酶與牧草的接觸面積增大更易于微生物的降解。氨化或堿處理牧草可溶解半纖維素和木質(zhì)素，進(jìn)而提高牧草消化率（Fahey等，1993）。另外，日糧的飼喂形式和飼喂頻率也會(huì)影響纖維的消化，飼喂?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)均衡的全混合日糧、易發(fā)酵日糧，以及少量多次飼喂，均可促進(jìn)瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，提高纖維分解菌的數(shù)量以及纖維消化率（Robinson，1989）。

2.2 微生物因素 細(xì)菌與底物的吸附能力是影響底物消化率的重要因素，也是植物細(xì)胞壁多糖降解的前提條件 （Fernando等，2012；Lynd等，2002）。微生物與底物的吸附可以在細(xì)胞和分子水平上影響其生理生化反應(yīng)（R·oper和 Koch，1988）。

細(xì)菌間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，并會(huì)相互抑制與底物的吸附（Fernando等，2012）。當(dāng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌與瘤胃球菌同時(shí)存在時(shí)，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的吸附數(shù)量明顯受到抑制，這可能是與球菌黏附快而產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌黏附慢有關(guān)。當(dāng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌完成與底物的吸附后，添加白色瘤胃球菌并不影響其吸附，但出現(xiàn)部分已黏附的黃色瘤胃球菌的脫落，這可能是因?yàn)檫@兩種球菌的黏附位點(diǎn)相同或在黏附過(guò)程中相互抑制所致，而球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的黏附位點(diǎn)不同（Mosoni等，1997）。當(dāng)原蟲與細(xì)菌或真菌共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞壁的降解速度較各微生物單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低，但真菌與細(xì)菌共培養(yǎng)時(shí)，出現(xiàn)互作效應(yīng)，從而提高細(xì)胞壁降解率（Lee等，2000）。

底物中微生物密度會(huì)影響其對(duì)纖維的吸附能力，高密度環(huán)境下，細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)則會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)纖維的吸附和消化（Fernando等，2012）。某些細(xì)菌釋放的多肽物質(zhì)和累積的產(chǎn)物也會(huì)抑制微生物的吸附 （Pettipher和Latham，1979）。 細(xì)菌表面糖蛋白質(zhì)也會(huì)影響細(xì)菌的吸附能力，當(dāng)細(xì)菌表面糖蛋白變性或構(gòu)象改變時(shí)，細(xì)菌對(duì)底物的吸附能力明顯降低。當(dāng)用高碘酸鹽、戊二醛和蛋白酶去除產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌表面的糖蛋白后，該菌與底物的黏附數(shù)量顯著降低（Gong和Forsberg，1989）。然而，用疊氮化鈉或甲醛殺死細(xì)菌，對(duì)細(xì)菌的黏附能力無(wú)影響，但是用加熱的方法（蛋白完全變性）可以強(qiáng)烈的抑制細(xì)菌的黏附能力（Roger等，1990）。

2.3 底物因素 植物組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁組分及其結(jié)構(gòu)等均會(huì)影響纖維的消化，大多數(shù)植物表皮存在一層蠟質(zhì)和角質(zhì)層，阻止了微生物對(duì)粗飼料的黏附。瘤胃細(xì)菌通常是通過(guò)對(duì)氣孔、皮孔或植物破損部位的入侵到達(dá)植物組織的內(nèi)部進(jìn)行對(duì)植物組織的進(jìn)一步消化和降解 （McAllister等，1994）。與此同時(shí)，底物大小和形狀也會(huì)影響微生物的吸附，飼料顆粒的表面積越大越有利于微生物對(duì)纖維的降解，因?yàn)榱鑫肝⑸锟梢愿玫厝肭值街参锏膬?nèi)部進(jìn)行附著和分泌纖維降解酶。反芻動(dòng)物在進(jìn)食時(shí)對(duì)粗飼料的咀嚼作用，可破壞粗飼料表皮的角質(zhì)層，增大吸附表面積，暴露出更多的可消化位點(diǎn)供微生物利用，從而有利于牧草纖維的降解（McAllister等，1994）。

2.4 環(huán)境因素 溫度的變化會(huì)顯著影響瘤胃微生物的吸附能力。研究表明，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在4、22℃和37℃條件下，對(duì)微晶纖維素的黏附率分 別 為 50%、79%和 82%（Gong和 Forsberg，1989）。在50℃以上時(shí)，白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的黏附率會(huì)降低，白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的黏附率均在 30～38 ℃時(shí)最大（Roger等，1990）。

pH對(duì)纖維分解菌的吸附作用的影響因不同細(xì)菌而異。對(duì)于產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，當(dāng)pH由4.5上升到6時(shí)，該菌對(duì)底物的黏附力有所增加；當(dāng)pH為6～7時(shí)，該菌的黏附力保持穩(wěn)定；當(dāng)pH大于7.5時(shí)，該菌的黏附力會(huì)急劇下降。對(duì)于黃色瘤胃球菌，當(dāng)pH為3.3～7.5時(shí)，該菌的黏附力較穩(wěn)定；當(dāng)pH上升到8時(shí)，該菌的黏附力會(huì)逐漸下降。對(duì)于白色瘤胃球菌，當(dāng)pH為5.5～8時(shí)，該菌的黏附力不受影響（Roger等，1990）。

底物中離子種類和濃度也會(huì)極大地影響瘤胃微生物的吸附。提高底物中Ca2+或Mg2+濃度時(shí)，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對(duì)纖維的黏附作用會(huì)顯著提高（Gong和 Forsberg，1989）。但 Roger等（1990）研究認(rèn)為，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子并不敏感，Na+對(duì)其黏附能力的影響更大。黃色瘤胃球菌的黏附能力并不單獨(dú)受Ca2+、Mg2+或Na+的影響，不過(guò)當(dāng)同時(shí)缺少兩種二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)，黏附作用則會(huì)顯著降低。

3 展望

牧草中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物是反芻動(dòng)物重要的能量來(lái)源，而纖維的降解是影響牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因素，瘤胃中微生物對(duì)不同牧草的降解規(guī)律存在一定的差異，因此，明確瘤胃微生物對(duì)不同牧草的降解機(jī)制對(duì)合理利用牧草纖維至關(guān)重要。雖然，目前關(guān)于牧草纖維降解機(jī)制的研究已取得一定進(jìn)展，但仍然有諸多問(wèn)題尚未解決，如對(duì)不同牧草結(jié)構(gòu)性碳水化合物瘤胃內(nèi)降解機(jī)制、代謝轉(zhuǎn)化途徑、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控功能，以及對(duì)乳品質(zhì)、肉質(zhì)調(diào)控影響的研究還有待深入。與此同時(shí)，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程等方法，開展纖維分解菌和低木質(zhì)化牧草育種以及新型高效纖維素酶的開發(fā)也將更有助于促進(jìn)牧草在畜牧生產(chǎn)中的高效利用。

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