郭曉鳳，張超賢，劉 雁，吳 菲，駱 欣

1杭州市西溪醫(yī)院感染科，杭州 310023 2新鄉(xiāng)醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100

恩替卡韋治療后乙型肝炎病毒多聚酶區(qū)耐藥基因檢測分析

郭曉鳳1，張超賢2，劉 雁1，吳 菲1，駱 欣1

1杭州市西溪醫(yī)院感染科，杭州 3100232新鄉(xiāng)醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100

目的研究恩替卡韋治療后乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶區(qū)基因變異情況。方法收集恩替卡韋治療后出現(xiàn)HBV病毒學突破患者的血清，采用聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)物直接測序，分析HBV-P區(qū)基因變異發(fā)生情況。結(jié)果29例患者中檢出恩替卡韋基因型耐藥19例，其中16例(84.2%，16/19)既往有拉米夫定治療失敗史；17例(58.6%，17/29)變異類型以rtL180+rtM204+rtT184為主；7例(24.1%，7/29)為B基因型，22例(75.9%，22/29)為C基因型。7例B基因型中檢出恩替卡韋基因型耐藥者4例(57.1%)，22例C基因型中檢出恩替卡韋基因型耐藥者15例(68.2%)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.665)。結(jié)論恩替卡韋基因型耐藥多出現(xiàn)于拉米夫定治療失敗后序貫治療，rtL180+rtM204+rtT184變異類型在B和C基因型的恩替卡韋耐藥中較為常見。

乙型肝炎病毒；耐藥基因；基因型；恩替卡韋

ActaAcadMedSin，2013,35(4)：444-446

在慢性乙型肝炎的治療中，抗病毒治療是關鍵。恩替卡韋更是由于其抗病毒活性強且耐藥發(fā)生率低，在我國2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中提出，如條件允許，開始治療時宜選用恩替卡韋[1]。但隨著恩替卡韋的廣泛應用，尤其在拉米夫定等其他核苷類似物耐藥的情況下序貫應用，一些患者經(jīng)恩替卡韋治療后出現(xiàn)病毒學突破導致治療失敗。本研究對此類患者進行了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)多聚酶區(qū)耐藥基因檢測和分析，以期為今后的臨床治療提供參考。

對象和方法

對象2008年1月至2011年12月在杭州市第六醫(yī)院就診并規(guī)范服用恩替卡韋(初治0.5 mg/d，拉米夫定治療失敗患者改換恩替卡韋1.0 mg/d)至少1年，出現(xiàn)病毒學突破的浙江籍慢性乙型肝炎患者29例，其中，男25例，女4例，平均年齡(36.7±10.4)歲(20～50歲)；所有病例診斷均符合2005年中華醫(yī)學會肝病學分會及感染病學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準[2]，均自愿提供詳細病史資料并接受抗病毒耐藥檢測。排除重疊感染、其他特異病因引起的慢性肝病、肝癌、肝硬化。病毒學突破及基因型耐藥等定義參照指南。

檢測方法及結(jié)果判定采用聚合酶鏈反應擴增HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcription，RT)區(qū)，由全自動測序儀(安瑪西亞公司MegBACE500測序儀)對PCR產(chǎn)物直接測序[3]檢測HBV-RT區(qū)常見的9個(169、173、180、181、184、202、204、236、250)耐藥位點的變異情況。結(jié)果判定：rtM204I/V為拉米夫定、替比夫定耐藥變異(LAM-R)，rtA181V、N236T為阿德福韋酯耐藥變異(ADV-R)，rtL180M、rtV173L為rtM204的補償耐藥變異，rtA181T/S可見于拉米夫定治療后HBV耐藥變異，rtI169T、rtT184A/C/F/G/I/L/M/S、rtS202C/G/I、rtM250I/L/V為恩替卡韋耐藥變異(ETV-R)。多位點變異(coexist-R)即LAM-R或ETV-R合并ADV-R。如果發(fā)現(xiàn)rtM204I/V及其補償變異rtL180M/rtV173L合并rt(184、169、202、250)位點中的任意一種變異即認定為恩替卡韋基因型耐藥。HBV基因型分型采用Taqman熒光PCR技術(shù)[4]，引物、探針及Taqman熒光PCR相關材料購于杭州博賽基因診斷技術(shù)有限公司。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

臨床資料及基因型分布29例患者中，7例(24.1%)為B基因型，22例(75.9%)為C基因型。B基因型和C基因型患者治療前的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)水平[(226±103)U/L比(251±91)U/L，P=0.549]、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis Be antigen，HBeAg)陽性率[71.4%比77.3%，P=1.000]、血清HBV DNA水平[(7.07±1.32)log10 copies/ml比(7.36±1.44)log10 copies/ml，P=0.627]差異均無統(tǒng)計學意義。

核苷類似物用藥情況及HBVRT區(qū)變異位點檢測結(jié)果29例患者，9例檢出LAM-R；1例檢出ADV-R；19例檢出ETV-R，其中，恩替卡韋初治3例(15.8%)，序貫恩替卡韋治療16例(84.2%)；未檢測到多位點耐藥變異。

HBVRT區(qū)變異類型、出現(xiàn)頻率及比例29例患者中，rtL180+rtM204+rtT184變異17例(58.7%)，其中M204I 1例，M204V 16例；rtL180+rtM204V+rtS202變異2例(6.9%)；rtL180+rtM204V變異5例(17.2%)；rtM204I變異3例(10.3%)；rtN236變異1例(3.4%)；rtA181T變異1例(3.4%)。核苷類似物序貫治療后HBV RT區(qū)變異類型較分散，rtM204單位點變異均為rtM204I；rtM204位點伴隨其他位點變異的24例中，僅1例為rtM204I(4.2%)，23例為rtM204V(95.8%)。

HBV基因型與ETV-R檢出率比較7例B基因型中檢出恩替卡韋基因型耐藥4例(57.1%)，22例C基因型中檢出恩替卡韋基因型耐藥15例(68.2%)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.665)。

討 論

HBV發(fā)生耐藥變異是核苷類似物長期抗HBV治療的最大障礙，伴隨耐藥變異發(fā)生的是病毒學突破、生物化學突破、組織學惡化、肝功能障礙和肝炎相關并發(fā)癥發(fā)生率的增加。恩替卡韋因其高耐藥基因屏障受到臨床醫(yī)生的青睞，但對拉米夫定治療后出現(xiàn)病毒學突破的患者序貫用恩替卡韋將導致恩替卡韋耐藥率明顯上升[5]。本研究中有19例患者檢出恩替卡韋基因型耐藥，其中恩替卡韋初治者3例；拉米夫定治療后出現(xiàn)HBV病毒學突破，序貫恩替卡韋治療者16例，該結(jié)果提示恩替卡韋基因型耐藥多出現(xiàn)在拉米夫定治療后，序貫應用恩替卡韋的患者中。恩替卡韋耐藥基因屏障的打破有賴于rtL180M+rtM204I/V的存在[6]，即拉米夫定耐藥位點(rt204)和伴隨變異位點(rt180)的變異再加上任意1個恩替卡韋耐藥位點rt(184、202、250)變異才能構(gòu)成臨床意義上的恩替卡韋耐藥。本研究檢測到的19例恩替卡韋基因型耐藥中，變異類型以rt204+rt180+rt184為主，占83.5%。rtM204單位點變異均為rtM204I，rtM204位點伴隨其他位點變異中以rtM204V變異為主，占95.3%。

治療前血清HBV DNA載量、ALT水平、HBeAg狀態(tài)可以預測核苷酸類似物的耐藥發(fā)生率[7]。為此，本研究對入組的B基因型、C感染者治療前血清HBV DNA載量、ALT水平、HBeAg狀態(tài)做了比較，結(jié)果顯示差異均無統(tǒng)計學意義，提示兩組基因型在病毒耐藥變異等方面的比較排除了其他主要因素的干擾。

HBV基因型是病毒變異進化的結(jié)果，根據(jù)HBV核苷酸序列的差異，可將其分為A～I共9種基因型，其分布具有地域性差異，我國以B型和C型為主，北方地區(qū)HBV感染以C基因型為主，南方地區(qū)以B基因型為主[8]。本研究對象來自南方地區(qū)，但29例患者中，HBV基因型構(gòu)成比以C基因型為主(75.4%)，而不是B基因型(24.1%)，分析原因可能與本研究對象為恩替卡韋治療后出現(xiàn)病毒學突破的慢性乙型肝炎患者相關。Liu等[9]在對中國1803例核苷類似物相關耐藥變異的觀察中發(fā)現(xiàn)，治療后出現(xiàn)病毒學突破的患者中，C基因型占84.2%，B基因型占15.0%。譚朝霞等[10]的研究結(jié)果顯示，核苷類似物治療后C基因型感染較B基因型感染易出現(xiàn)病毒學突破。C基因型病毒復制水平高于B基因型，而高復制HBV易發(fā)生病毒變異[11]，恩替卡韋治療后C基因型感染是否比B基因型感染易出現(xiàn)病毒學突破尚需進一步觀察研究。本組7例B基因型患者中檢出恩替卡韋基因型耐藥者4例，22例C基因型中檢出恩替卡韋基因型耐藥者15例，差異無統(tǒng)計學意義。推測可能是由于樣本量太少，故基因型與恩替卡韋基因型耐藥的關系尚需擴大樣本量進一步觀察分析。

總之，恩替卡韋耐藥多由拉米夫定治療后出現(xiàn)病毒學突破序貫應用引起，恩替卡韋的初始治療才能體現(xiàn)其高耐藥基因屏障的優(yōu)勢。HBV基因型與恩替卡韋治療后HBV病毒學突破及恩替卡韋基因型耐藥檢出率的關系須擴大樣本量進行進一步觀察分析。

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Drug-resistantGenesatHepatitisBVirusPolymeraseRegionduringEntecavirTreatment

GUO Xiao-feng1，ZHANG Chao-xian2，LIU Yan1，WU Fei1，LUO Xin1

1Department of Infectious Diseases，Hangzhou Xixi Hospital，Hangzhou 310023，China2Department of Gastroenterology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Weihui，Henan 453100，China

GUO Xiao-feng Tel：0571- 86481526，E-mail：guoxf137@163.com

ObjectiveTo investigate the drug-resistant genes at hepatitis B virus(HBV)polymerase region during entecavir(ETV)treatment.MethodsSerum samples from chronic hepatitis B patients with virologic breakthrough during enticavir therapy were studied.The resistant mutation patterns in the polymerase gene of hepatitis B virus were analyzed using the polymerase chain reaction(PCR)-sequencing method.ResultsETV resistance was detected from 19 out of 29 ETV-refractory patients，among whom 16(84.2%)had a hisotry of lamivudine-refractory.The mutation patterns were diverse，while rtL180+rtM204+rtT184(58.6%，17/29)was most common in patients with ETV genotype resistance.Four of 7 patients(7/29，24.1%)with genotype B were detected to have ETV genotype resistance，while 15 of 22 patients(22/29，75.9%)with genotype C were detected to have ETV genotype resistance.The rate of ETV genotype resistance was 57.1%(4/7)and 68.2%(15/22)in patients with genotype B and genotype C，while no statistical difference was found(P=0.665).ConclusionsETV genotype resistance is more common in patients who have been refractory to ETV and lamivudine sequential treatment.rtM204+rtL180+rtT184 mutation is common in genotype B and C ETV resistance patients.

hepatitis B virus；drug-resistant genes；genotype；entecavir

郭曉鳳 電話：0571- 86481526，電子郵件：guoxf137@163.com

R512.6+2

A

1000- 503X(2013)04- 0444- 03

2012-05-21)

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2010A016)Supported by the Medical Fund of Hangzhou(2010A016)

10.3881/j.issn.1000- 503X.2013.04.016