陳國慶 綜述 楊 樺 審校 (第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，重慶400037)

Notch是一種物種間表達高度保守的跨膜蛋白受體，其在胚胎及出生后個體的生長發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。Notch首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，因其功能缺失后果蠅翅膀產(chǎn)生缺口而得名。在哺乳動物中，Notch受體有4種:Notch1-Notch4，其配體分為Delta like與 Jagged兩類，前者包括 Delta1、Delta3、Delta4或 DLL1、DLL3、DLL4，后者包括 Jagged1 和Jagged2。當(dāng)配體與Notch受體結(jié)合而將其激活后，Notch活性片段進入細(xì)胞核，調(diào)控Notch靶基因HES家族或HEY家族的表達。在胸腺和骨髓中，Notch受體的激活可促進淋巴前體細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞方向進行分化［1，2］。胸腺和骨髓內(nèi)形成的T淋巴細(xì)胞進入周圍淋巴組織后，CD4+T淋巴細(xì)胞需在抗原呈遞細(xì)胞所呈遞抗原的刺激下逐漸分化為Th1或Th2效應(yīng)淋巴細(xì)胞，然后參與機體的抗原特異性免疫反應(yīng)。此前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞Th1和Th2方向的分化中起著重要作用［3，4］，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Notch表達同樣在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞分化中起重要作用，并調(diào)控其活性。本文就Notch通路及其在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞的活性和兩極分化中的調(diào)控作用作一綜述。

1 Notch信號通路概述

1．1 CSL參與的Notch經(jīng)典信號通路 哺乳動物Notch受體由N1-N4四個基因編碼，每一個基因都合成單獨的跨膜多肽，新合成的Notch前體蛋白在高爾基體中進行加工修飾后轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面形成異源二聚體，其中包括細(xì)胞內(nèi)片段和細(xì)胞外片段［5，6］。當(dāng)配體與Notch受體結(jié)合后，Notch受體胞外片段發(fā)生構(gòu)象變化，ADAM金屬蛋白酶切割胞內(nèi)片段使其從細(xì)胞膜表面脫落，脫落的胞內(nèi)片段再經(jīng)過γ-分泌酶的切割修飾后形成Notch受體的細(xì)胞內(nèi)活性片段NICD(Notch1 intracellular domain，NICD)，并轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核［7，8］。NICD進入細(xì)胞核后與核結(jié)合蛋白CSL(CBF1 suppressor of hairless-Lag1，CSL)(小鼠為RBP-J)相結(jié)合并啟動靶基因HES的轉(zhuǎn)錄，這是研究較多的經(jīng)典通路［9］。在Notch未被激活的狀態(tài)下，CSL與羧基末端結(jié)合蛋白CTBP1(Carboxy-terminal binding protein 1，CTBP1)等分子組成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻斷Notch靶基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始位點，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在CTBP1基因敲除小鼠中，Notch靶基因Hey1表達即明顯增強［10］。另外，NICD與CSL結(jié)合后，組蛋白乙?；窹300、P300/CBP相關(guān)因子PCAF可進一步激活NICD-CSL復(fù)合物，促進Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄［11］。

1．2 NF-κB參與的Notch信號通路 經(jīng)典通路中，Notch受體激活后，其活性片段NICD進入細(xì)胞核與CSL(RBP-J)結(jié)合，并啟動靶基因HES的轉(zhuǎn)錄。但是，將小鼠RBP-J基因敲除后的研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞Notch受體激活后其分泌IFN-γ仍舊升高明顯，同時HES1和HES5表達無明顯變化。這提示我們，Notch受體激活后有其他的信號傳導(dǎo)通路［12］。

既往研究已明確，T淋巴細(xì)胞表面TCR受體的激活可促進NF-κB的活性;TCR的激活還可促進Notch受體的激活，這提示在TCR激活的T淋巴細(xì)胞中 NF-κB和 Notch受體之間可能存在相互作用［13］。近來研究表明，Notch受體與 NF-κB之間的確存在著密切聯(lián)系。Notch1可以激活NF-κB，并且Notch1可通過CSL依賴的方式調(diào)控NF-κB抑制劑IκBα 的水平［14，15］。T 淋巴細(xì)胞的 Notch 受體激活后，其活性片段NICD與NF-κB的相互作用促進了NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的停留，從而促進了 NF-κB與DNA的結(jié)合及其作用的發(fā)揮［16］。在Notch1低表達的小鼠中，周圍T淋巴細(xì)胞的NF-κB活性降低，IFN-γ 分泌減少［17］;相反，在 Notch3過表達小鼠中，胸腺細(xì)胞的NF-κB持續(xù)被激活，可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生［18］。反過來，NF-κB 還可以影響Notch信號通路。T淋巴細(xì)胞中，NF-κB被激活后，其組成之一Rel蛋白可促進Notch配體Jagged1的表達，并促進 Jagged1與 Notch受體的結(jié)合［19］。這說明，Notch受體與NF-κB之間存在相互聯(lián)系。免疫共沉淀研究亦證實，Notch和NF-κB、NICD和Rel形成復(fù)合物結(jié)合于 IFN-γ編碼基因的啟動子區(qū)域［16］。有意義的是，研究證實 CSL 與 NF-κB 在DNA的結(jié)合位點序列有重疊區(qū)域，二者之間可能存在著結(jié)合目的DNA序列的競爭性機制，共同調(diào)控Notch下游靶基因的表達，但具體機制有待進一步研究［20］。

2 Notch通路調(diào)控周圍T淋巴細(xì)胞的活性

此前研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路激活后可阻斷促凋亡核受體蛋白Nur77的活性，從而抑制TCR激活后引起的T淋巴細(xì)胞的凋亡［21］。GSK3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)是一種糖原合成酶激酶，Notch受體激活后可促進PI3K/AKT通路的激活而磷酸化GSK3β，抑制GSK3β的活性，并促進抗凋亡蛋白BCL-2的表達，抑制細(xì)胞的凋亡，應(yīng)用Notch受體激活的阻斷劑后細(xì)胞凋亡明顯增多［22］。另一方面，GSK3β是Notch信號通路的抑制劑，而PI3K/AKT又可通過GSK3β抑制Notch通路的活性［23，24］。上述研究表明，Notch 信號通路與 PI3K/AKT通路間存在相互作用，Notch信號通路激活后具有抑制T淋巴細(xì)胞凋亡的功能，PI3K/AKT通路介導(dǎo)此作用。

T淋巴細(xì)胞表面受體TCR的激活可引起細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)控T淋巴細(xì)胞的活性。研究進一步發(fā)現(xiàn)，TCR激活后可通過促進Notch受體的激活而影響T淋巴細(xì)胞的活性。激活周圍CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞TCR受體的同時阻斷Notch受體的激活則抑制了 T淋巴細(xì)胞的增殖及 IFN-γ的分泌［17］。在CD4+T淋巴細(xì)胞中，其CD4分子與Notch受體共定位在細(xì)胞表面，CD4受體激活后促進CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-10，但阻斷Notch受體激活后IL-10分泌被抑制［25］。與此研究結(jié)果一致的是，脂多糖LPS激活的抗原呈遞細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后促進CD4+T淋巴細(xì)胞的IL-10分泌和CD8+T淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌［26］。腺病毒激活的抗原呈遞細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，促進T淋巴細(xì)胞Th1和Th2活性，表現(xiàn)為促進其IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌［27］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體促進T淋巴細(xì)胞IL-2分泌的同時，還可促進T淋巴細(xì)胞表面IL-2受體的表達，從而參與了 IL-2的正反饋調(diào)控［13］。上述研究提示Notch受體在T淋巴細(xì)胞的活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

3 Notch通路調(diào)控周圍T淋巴細(xì)胞的兩極分化

近來研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體調(diào)控激活的T淋巴細(xì)胞向Th1、Th2或調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞向Tr方向進行分化。

3．1 Notch受體調(diào)控T淋巴細(xì)胞的Th1方向分化

研究發(fā)現(xiàn)，DLL1可激活CD4+T淋巴細(xì)胞表面Notch3受體，促進激活的CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進行分化［28］。在此研究中，純化的CD4+T淋巴細(xì)胞與DLL1共培養(yǎng)，CD4+T淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌增多、IL-4分泌減少;然后通過轉(zhuǎn)染的方式使CD4+T淋巴細(xì)胞過表達Notch-3后與DLL1共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達Notch-3的CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ進一步升高。上述結(jié)果表明，DLL1-Notch-3通路促進了CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化。T-bet是一種選擇性地表達于Th1細(xì)胞的新型轉(zhuǎn)錄因子。DLL1與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞的T-bet表達即明顯升高［3］。另外，體內(nèi)實驗中，給予小鼠體內(nèi)注射DLL1，機體由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的抗寄生蟲的免疫反應(yīng)明確增強［28］。上述研究證實了Notch受體激活后具有促進CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進行分化，并促進其對病原體反應(yīng)的功能。

體外研究進一步發(fā)現(xiàn)，Notch受體在最初48小時內(nèi)決定CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進行分化［29］。CD4+T淋巴細(xì)胞在促Th1方向分化的環(huán)境中培養(yǎng)，在48小時內(nèi)阻斷Notch受體后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化失敗，表現(xiàn)為特異性表達于Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的編碼基因Tbx21不再表達;但是在Notch受體被阻斷的條件下，通過病毒轉(zhuǎn)染方式使CD4+T淋巴細(xì)胞再次表達Notch-1受體的激活片段NICD后，Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的編碼基因Tbx21再次表達;而且研究證實，NICD、CSL明確結(jié)合于Tbx21基因的啟動子區(qū)域，這提示Notch1受體具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞向Th1方向進行分化的功能。

3．2 Notch受體調(diào)控T淋巴細(xì)胞的Th2方向分化

Notch受體在CD4+T淋巴細(xì)胞的Th2方向分化中同樣起著調(diào)控作用［30，31］。在上文提及的研究中，CD4+T淋巴細(xì)胞與表達DLL1的抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化，并分泌IFN-γ［28，29］;然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T 淋巴細(xì)胞與表達Jagged1的抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化，并分泌IL-4和IL-5;而且，將 CD4+T淋巴細(xì)胞的 RBP-J基因敲除后，CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-4明顯降低，說明RBP-J參與了此過程［30］。在RBP-J基因敲除小鼠的研究支持了上述觀點，RBP-J參與了Notch激活后促進IL-4 表達的通路［32］。

MAML1蛋白是一種促進Notch靶基因表達的轉(zhuǎn)錄輔激活因子。針對MAML1基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠周圍T淋巴細(xì)胞發(fā)育正常，且主要表現(xiàn)為Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng);當(dāng)小鼠腸道感染鼠鞭蟲時，機體因缺乏Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而不能徹底清除鼠鞭蟲感染［31］。

另有對CD4+T淋巴細(xì)胞的Notch1基因特異性敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1通路不參與CD4+T淋巴細(xì)胞的Th1或Th2方向分化，而且不參與Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但是此研究中未考慮其他Notch 受體的作用［33］。

上述各個研究的研究方法、模型之間存在很大的差異，研究結(jié)果也不完全一致，關(guān)于Notch通路在T淋巴細(xì)胞分化中的作用尚有爭議，需要進一步的研究。

3．3 Notch受體調(diào)控調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞Tr的分化

調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞是不同于Th1和Th2的具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，因其具有免疫抑制作用，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，近來受到人們的廣泛關(guān)注。根據(jù)Tr表面標(biāo)記、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和作用機制的不同，Tr可分為CD4+CD25+Tr細(xì)胞、Tr1和Th3等多種亞型。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用表現(xiàn)在激活以后抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，在CD4+CD25+Tr細(xì)胞激活后，其DLL1表達升高［18］。而且，給予CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染DLL1后，明確抑制了T淋巴細(xì)胞的增殖活性和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這提示DLL1-Notch通路在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［34］。Jagged1同樣在免疫抑制中發(fā)揮作用;轉(zhuǎn)染后過表達Jagged1的抗原呈遞細(xì)胞可促使CD4+T淋巴細(xì)胞向Tr方向進行分化，并抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［35］。

針對小鼠心臟移植后排斥反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)表達DLL1的抗原呈遞細(xì)胞促進了Tr的生成，抑制IFN-γ的分泌，并同時促進了IL-10的分泌，從而明顯降低了移植物的免疫應(yīng)答反應(yīng)［36］。

4 總結(jié)和展望

從上述一系列的研究可發(fā)現(xiàn)，抗原呈遞細(xì)胞表達Notch受體配體Jagged或DLL，激活CD4+T淋巴細(xì)胞的Notch信號通路，這在CD4+T淋巴細(xì)胞的分化和活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。但是，相關(guān)研究剛剛起步，發(fā)表的成果很少，而且各個研究的模型、方法并不相同，各個研究的結(jié)果也并不完全一致。Notch通路在Th1、Th2分化及活性中的作用尚無定論。相信隨著更多研究的發(fā)表，更加標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法和模型會逐步確立，Notch通路在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞中的調(diào)控作用會進一步明確。

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