李 陽，劉 浩，蔣志文

(蚌埠醫(yī)學院藥學系，安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽蚌埠 233000)

硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proglycan，HSPG)是細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的重要組成部分，也可作為受體迅速結合生長因子、趨化因子、酶等近百個不同的蛋白質(zhì)。他由一個核心蛋白與多個線性硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)側鏈共價連接而成，其HS側鏈帶有負電荷具有高度活性，是HSPG的活性關鍵部位。乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是哺乳動物體內(nèi)唯一能切割ECM中HS側鏈的內(nèi)切性糖苷酶，這也是Hpa影響很多生理病理過程的原因。Hpa可以影響骨、血管、毛發(fā)等形成和生長，對腫瘤的生長分化、侵襲轉(zhuǎn)移也有著重要作用，在多種惡性腫瘤中Hpa的高表達高活性狀態(tài)表明其可能成為一個抗腫瘤治療的新靶點［1－2］。本文通過對Hpa在腫瘤中的表達及調(diào)控進行綜述，以期為以Hpa為靶點的腫瘤治療尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 Hpa的生物學功能

Hpa發(fā)現(xiàn)于1999年，是一個內(nèi)源性β2葡萄糖醛酸酯酶，能特異性識別并剪切HS側鏈。研究發(fā)現(xiàn)人類Hpa有兩種亞型，Hpa1與Hpa2。由于分布和功能不同，目前在腫瘤的研究中主要以Hpa1為主，它是由兩條多肽鏈以非共價鍵方式結合而成的異二聚體。在正常組織中，Hpa1 mRNA在胎盤之外的成熟非免疫組織中均不表達，但在惡性腫瘤細胞中普遍高表達。

在人類胎盤中，Hpa的兩種轉(zhuǎn)錄子都呈現(xiàn)高表達，尤其在滋養(yǎng)層細胞溶解物中活性很高，這可能是Hpa促進血管新生和滋養(yǎng)層細胞侵襲基底膜(basement membrane，BM)的重要因素。Hpa活性降低后，結合的各種物質(zhì)作用均受到抑制，滋養(yǎng)層細胞的分裂減速。血管生成涉及了生長因子、ECM、粘附受體分子及基質(zhì)降解酶等一系列的因素，HSPG作為血管的重要組成部分［3］，這為Hpa影響血管生成、滋養(yǎng)層細胞的浸潤奠定了物質(zhì)基礎。在增生的人類內(nèi)皮細胞、皮膚和創(chuàng)面肉芽組織中發(fā)現(xiàn)，Hpa高表達刺激了角質(zhì)細胞遷移，加強了傷口上皮細胞和血管的成熟，明顯提高了皮瓣成活，說明Hpa在傷口愈合處介導增強皮膚的血管生成［4］并使組織修復加速。而在腫瘤進展的方面，Hpa對HS側鏈的切割可以破壞BM和ECM，釋放其中的生長因子，進而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。

2 腫瘤細胞中Hpa的表達和調(diào)控

Hpa在轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細胞中普遍高表達，其促進腫瘤轉(zhuǎn)移的機制是目前研究熱點［5－6］之一，涉及到多因素多過程，除酶活性啟動通路，AKT、Rac1、Src磷酸化及堿性成纖維細胞生長因子等均參與其中。腫瘤細胞中Hpa表達與多種因素有關，包括外源環(huán)境和細胞因子等內(nèi)源因素的影響。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控 細胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏、糖基化抑制、化療藥物、氧化應激等多種因素作用下，均會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白堆積。其中由蛋白質(zhì)堆積所引起蛋白質(zhì)合成減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解功能增強等后續(xù)反應，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。UPR是一種復雜的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應，能夠限制非折疊蛋白的累積，最初效應是保護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，限制其他細胞器的損害，通過減少細胞的過度應激而保護機體［7］。UPR提高細胞在有害因素下的生存能力，但未折疊的蛋白長時間積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)便會對細胞產(chǎn)生毒性，當UPR信號通路不能緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)時便會啟動細胞凋亡程序［7］。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激最終方向是不利于細胞生存的，可在這過程中UPR的激活又使腫瘤細胞得以存活，腫瘤向更惡性的方向發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)［8］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein，GRP78)升高能夠促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，而在本實驗室的研究中，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)能夠促進乳腺癌細胞離開原來的應激環(huán)境，通過加速腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移使其得以生存，而這與UPR激活Hpa有著密切聯(lián)系，其具體機制尚需進一步研究。

2.1.1 缺氧及pH 腫瘤缺氧時，UPR使腫瘤適應低氧環(huán)境，ATP生成減少，而蛋白質(zhì)的折疊是ATP依賴的過程，能量不足會影響蛋白質(zhì)折疊，這些因素都使得未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。處于缺氧狀態(tài)的腫瘤細胞仍能不斷增殖、浸潤，在這個過程中低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)起著重要的作用。HIF-1是廣泛存在于腫瘤中的轉(zhuǎn)錄因子，也是腫瘤微環(huán)境缺氧的重要標志物之一。在惡性腫瘤生長過程中，由于組織增生過快必然會造成局部組織嚴重缺氧，HIF-1蛋白水平增加，加強腫瘤細胞代謝的適應性，促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等血管生成基因的轉(zhuǎn)錄［9］，繼而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)［10］，在正常組織中Hpa僅在胚胎和淋巴結中高表達，其活性也多處于失活狀態(tài)，而在大部分易侵襲轉(zhuǎn)移的缺氧惡性腫瘤中Hpa表現(xiàn)為高表達高活性狀態(tài)，缺氧可以激活Hpa，這提示我們?nèi)毖跻蜃訁⑴c了腫瘤細胞中Hpa表達過程或參與了對其活性的調(diào)控。

Hpa僅在pH 4.0-7.5的酸性環(huán)境中發(fā)揮作用，其最佳表達活性是在pH 5.5-5.8之間，pH值越高其活性越低。腫瘤中心部位缺血缺氧都將為Hpa提供一個適宜的酸性環(huán)境，使其發(fā)揮酶的最大降解活性。如果pH大于8.0 Hpa就會失去活性，但仍擁有黏附作用。失活的Hpa和ECM中的HS結合，可作為內(nèi)切糖苷酶的儲庫，以便炎癥時能馬上降解ECM和BM，便于白細胞向血管外和基質(zhì)中游走。因此，局部組織的pH能夠調(diào)節(jié)Hpa的表達及活性［11］。

2.1.2 放療及藥物調(diào)控 放療對Hpa有著重要的影響，在治療胰腺癌的過程中發(fā)現(xiàn)臨床相關劑量的電離輻射(Infrared，IR)能上調(diào)Hpa的表達，從而增加胰腺癌的轉(zhuǎn)移［12］。放療和化療藥物可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，IR單獨運用于胰腺癌治療時，可能會通過激活UPR和Hpa而促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。結合了Hpa抑制劑后能夠抵消IR增強胰腺癌細胞體外侵襲的作用，減少原位胰腺腫瘤在體內(nèi)的擴散，對防止腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移是一種有效策略。

Hpa的底物HSPG具有2個結構特點，即含硫酸基團和糖鏈，并帶負電荷，故凡具備上述特點的生物或化學物質(zhì)均有可能抑制Hpa活性。Hpa抑制劑分為三類，HS類似物、活性抑制劑和植物多糖。由于肝素或低分子量肝素等抗凝劑有出血等并發(fā)癥，其用于腫瘤治療受到限制。但將抗凝和抗Hpa的屬性分開后，通過化學修飾得到了一系列的HS類似物，在高劑量時無風險，可以作為潛在的抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移藥物，如低分子量肝素、SST001和 PG545。PI-88［13］是含硫酸基的寡糖，由低聚糖磷酸鹽經(jīng)磺化作用而生成。PI-88一方面可以直接抑制Hpa的活性，同時它又通過阻抗血管生成因子及其受體與HS的相互作用，刺激凝血激酶途徑阻滯劑的釋放，從而產(chǎn)生抗血管生成的作用，達到抗腫瘤的目的。OGS 通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn) 2，3-二氫-1，3-二氧-1H-異吲哚-5-羧酸化合物具有抑制Hpa活性的作用，在此基礎上進行衍生物合成，獲得的一系列小分子抑制劑，OGT2115作為其中最具有效果的一種，分子式為C24H16BrFN2O4，在體外實驗中體現(xiàn)了很強的抗Hpa活性。寡聚的硫酸甘露糖醛酸(oligomannurarate sulfate，JG3)作為Hpa抑制劑的一種，在體內(nèi)外都有良好的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用［14］。它與Hpa的相互作用受到低分子量的肝素的競爭，但不受其他黏多糖的影響。此外，這種化合物可以通過抑制堿性成纖維細胞生長因子b-FGF從ECM中的釋放，抑制血管生成。

2.2 內(nèi)源因子調(diào)控

2.2.1 細胞因子和酶 Hpa可被一些蛋白酶，如胰蛋白酶和尿激酶等滅活，在炎癥發(fā)生以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移時，機體會大量分泌免疫因子，刺激細胞分泌Hpa，使細胞獲得在ECM中游走的能力。腫瘤壞死因子TNF-α，γ-干擾素和脂肪酸可以使內(nèi)皮細胞分泌Hpa蛋白增加，VEGF可使其分泌降低。b-FGF是一種強有力的血管生成因子，具有結合肝素的特性，Hpa與b-FGF在肝癌、胰腺癌、肺癌、胃癌等組織中均呈高表達且成正相關，說明它們在促進腫瘤細胞擴散轉(zhuǎn)移、血管生成中發(fā)揮重要的協(xié)同作用。而早期在黑色素瘤B16細胞和T細胞淋巴瘤的研究中［15］，Hpa促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)也密切相關。MMPs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，增強Hpa的表達可以導致MMP-9增強，Hpa基因沉默后導致 MMP-9失活。Hpa的激活同時也決定了其他MMPs的活化，尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和其受體(uPAR)也均會響應，這些研究結果首次提供了Hpa和MMPs之間合作調(diào)節(jié)細胞表面和ECM中的HSPGs的證據(jù)。

2.2.2 上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)EMT是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成為具有活動能力的間質(zhì)細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，它存在于人體多個生理和病理過程中。EMT的發(fā)生涉及到多個信號轉(zhuǎn)導通路和復雜的分子機制，并與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移關系密切。在腎病疾病末期時，EMT參與腎間質(zhì)成纖維化并在近端腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化成肌纖維母細胞中有著重要作用。FGF-2在腎小管上皮細胞中誘導了EMT的出現(xiàn)，并與Syndecan-1相關。Syndecan-1是跨膜HSPG家族成員之一，表達于大多數(shù)上皮細胞，在不同的細胞類型和發(fā)育階段表達均有不同。Syndecan-1在多種腫瘤細胞中的表達下降，與腫瘤細胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移過程密切相關，可作為判斷多種腫瘤預后的指標。研究發(fā)現(xiàn)，Hpa對HS/Syndecans正確轉(zhuǎn)變是至關重要的，一個錯誤的HS/Syndecans調(diào)控會妨礙FGF-2的活性。雖然FGF-2在野生型細胞株中誘導EMT，但它對Hpa沉默細胞是無效的，因此Hpa在腎小管上皮細胞中對誘導EMT是必要的。Hpa與EMT在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中是協(xié)同作用，F(xiàn)GF-2誘導的EMT通過PI3K/AKT通道，降解Syndecan-1，增加Hpa和MMP-9的表達［16］。而本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后Hpa的表達增加，且同時可誘導出現(xiàn)EMT，二者是否協(xié)同影響了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移仍需要進一步研究。

2.3 基因調(diào)控

2.3.1 啟動子甲基化和抑癌基因p53DNA甲基化是Hpa活性的重要抑制因素，DNA去甲基化可上調(diào)Hpa基因的表達。前列腺癌組織與正常組織相比，啟動子甲基化水平較低，但Hpa的表達及活性均偏高。惡性組織中甲基化調(diào)控Hpa這一過程被干擾，Hpa啟動子基因表達增加，造成了腫瘤轉(zhuǎn)移和血管新生。p53基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，是細胞凋亡的重要調(diào)控基因，分為野生型和突變型。野生型p53基因是一種抑癌基因，可限制多種應激因素引起的過度細胞生長，如DNA損傷、癌基因的活化、組織缺氧等。野生型p53被去除或活性抑制后均可導致Hpa表達和活性的明顯增高，這是由于野生p53結合Hpa啟動子并抑制其活性，而p53基因突變后就不能發(fā)揮此種抑制作用［17］。

2.3.2 MicroRNA MicroRNAs(miRNAs)是一類保守的非編碼單鏈RNA，約8－25個核苷酸，通過與靶基因mRNA互補位點的結合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。miRNAs直接作用于約30%的人類基因，而且?guī)缀鯀⑴c所有的生物過程，最近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中miRNAs的表達失調(diào)參與了腫瘤轉(zhuǎn)移。CascioS［18］等通過模擬MCF-7乳腺癌細胞低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)miR-20b能夠通過調(diào)節(jié)HIF-1及STAT-3通路從而下調(diào)VEGF的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，起到抑癌基因的作用。而在腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，miRNAs的引入對Hpa的表達起著增加或抑制的作用。miR-1258的水平與Hpa相關表達成反比，而各種浸潤型腫瘤的實驗中也驗證了這個結果，這說明miR-1258是通過調(diào)控Hpa的表達而起作用，這為以Hpa為靶點治療提供了分子依據(jù)［19］。

2.3.3 其它 Ets啟動子家族參與了Hpa mRNA在癌細胞中的表達，Ets1、Ets2有激活惡性乳腺癌細胞Hpa基因的功能，Ets成員之一GA結合蛋白需要和Sp1結合，共同調(diào)控甲狀腺腫瘤細胞Hpa轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)早期生長反應基因-1能影響Hpa的表達和活性，且在不同類型腫瘤中通過不同的機制調(diào)控Hpa的表達。早期生長反應基因-1是具有鋅指結構的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，早期即可對多種信號產(chǎn)生反應而增加表達，從而調(diào)節(jié)Hpa1的轉(zhuǎn)錄。NF-κB作為細胞內(nèi)較為下游的轉(zhuǎn)錄因子，參與了多條信號途徑，而在腫瘤細胞中也可調(diào)控Hpa1的表達。抑制NF-κB可以下調(diào)MMP-9、纖溶酶原激活物和Hpa1，從而阻止了自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移。結腸癌細胞中真核細胞起始因子24E(eukaryotic initiation factor24E，eIF24E)被抑制后，Hpa的活性和表達均下降，并伴有癌細胞體外侵襲力的下降，這在LS-174T細胞中已被報道［20］。

3 展望

Hpa在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段中均有表達，其促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用被闡明后，為人們治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供了新的思路。近年來以Hpa為靶點的藥物研發(fā)也取得了一些重要的進展，尤其是HS類似物的臨床研究［21］。此外，來自人Hpa的多肽可以引出一個對自體淋巴細胞沒有殺傷作用的抗腫瘤免疫反應，這為以Hpa為基礎的腫瘤免疫治療也奠定了基礎。由于Hpa在腫瘤組織中的重要性，研究Hpa在腫瘤中的表達調(diào)控及其機制對腫瘤的治療尤其是在侵襲轉(zhuǎn)移方面有著重大的意義。

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