田 燁，趙 涵，陳子江

山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 國家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心生殖內(nèi)分泌教育部重點實驗室 山東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，濟南 250021

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，E3泛素連接酶決定了泛素化過程的特異性。高等真核生物體內(nèi)存在1000多種E3泛素連接酶，其中Cullin-Ring類E3連接酶 (cullin-ring-based E3-ligases，CRLs)占主體地位［1］。Cullin蛋白作為支架參與CRLs蛋白復(fù)合體的構(gòu)成，在DNA復(fù)制、細胞周期、DNA損傷修復(fù)、腫瘤抑制、生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

CRLs家族成員是以蛋白復(fù)合體形式存在，包括小RING蛋白 (ROC1、ROC2)、Cullin蛋白、linker(如SKP1、ElonginB/C、DDB1等)和底物識別亞單位 (substrate recognize subunit，SRS)，如:F-box、DCAF等。Cullin蛋白發(fā)揮著支架作用，其本身不含有RING結(jié)構(gòu)域，而是在C端結(jié)合1個含有RING的小蛋白ROC1/ROC2，在人體內(nèi)共存在7種Cullin蛋白，CUL-1、CUL-2、CUL-3、CUL-4A、 CUL-4B、CUL-5、CUL-7［2］。與其他E3類泛素連接酶不同，CRLs家族成員并不和底物直接結(jié)合，而是通過一系列SRS特異性結(jié)合底物，從而使泛素從E2結(jié)合酶轉(zhuǎn)移到底物上。其中，已被解析結(jié)構(gòu)的CRL主要有CUL-1參與的SCF復(fù)合物 (F-box/SKP1/CUL-1/ROC)的晶體結(jié)構(gòu)、CUL-4A參與的CRL-4s復(fù)合物 (DCAF/DDB1/CUL-4A/ROC)的晶體結(jié)構(gòu)［3］，因此兩者在結(jié)構(gòu)及功能學(xué)上的研究較為深入。

CUL-1與SCF復(fù)合物

CUL-1可與Skp1、ROC、F-box共同構(gòu)成SCF復(fù)合物，SCF是研究最多的E3連接酶，因此對SCF復(fù)合物中除CUL-1之外其他組分—F-box與生殖系統(tǒng)疾病的關(guān)系略作介紹。F-box發(fā)揮著特異性識別底物的作用，目前已鑒定的人體內(nèi)F-box有70余種，在生殖系統(tǒng)中與配子的發(fā)生［4］、減數(shù)分裂［5］、卵子的儲備［6］有關(guān)。

CUL-1與胚胎發(fā)育 CUL-1是SCF復(fù)合物中的支架蛋白，和胚胎的早期發(fā)育密切相關(guān)。Pennetier等［7］發(fā)現(xiàn)和腸、肺、骨骼肌等的體細胞相比，在牛的卵母細胞中CUL-1有明顯的表達優(yōu)勢，這種空間表達特異性提示CUL-1可能在配子的發(fā)生、受精及早期胚胎發(fā)育中有重要作用。另外，在CUL-1基因敲除小鼠在胚胎第6.5天原腸胚形成之前胚胎發(fā)育停止，CUL-1－/－鼠囊胚體外培養(yǎng)時可觀察到其增殖能力下降，這說明CUL-1在哺乳動物胚胎的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用［8-9］。

F-box與生殖系統(tǒng)疾病 在SCF復(fù)合物中，Skp2是研究較多的一類F-box，可作用于下游的p27，在很多婦科腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中均可檢測到p27表達的下調(diào)及Skp2表達的上調(diào)，而且二者表達水平的改變和腫瘤的生物學(xué)行為 (浸潤、轉(zhuǎn)移)、腫瘤分級以及患者的預(yù)后等相關(guān)［10-12］。Skp2和卵巢早衰 (premature ovary failure，POF)可能相關(guān)，POF是指女性患者40歲之前提前絕經(jīng)，內(nèi)分泌學(xué)特點是雌激素水平低下而促性腺激素水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)，Skp2基因敲除的小鼠胚胎期卵巢細胞凋亡增加，有功能的配子儲備減少，從而導(dǎo)致性成熟后卵巢早衰出現(xiàn)［6］，但目前還未有 POF患者和Skp2相關(guān)的臨床證據(jù)。

綜上，從結(jié)構(gòu)上來講，CUL-1是SCF復(fù)合體不可或缺的組成部分;從功能上講，CUL-1和胚胎的早期發(fā)育直接相關(guān)，而SCF復(fù)合體中F-box(Skp2)與宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，與目前病因并不明確的可表現(xiàn)為婦科內(nèi)分泌異常的疾病卵巢早衰可能有一定相關(guān)性，為明確其病因提供了新的線索，而CUL-1在生殖系統(tǒng)疾病中的功能有待進一步研究。

CUL-2和CUL-5

減數(shù)分裂與卵的產(chǎn)生 CUL-2和CUL-5在生殖系統(tǒng)中的功能研究多數(shù)來自模式生物—秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅。在秀麗隱桿線蟲中，CUL-2和減數(shù)分裂及胚胎的極性相關(guān)［13］，CUL-2失活可導(dǎo)致 CyclinB1降解異常，致使減數(shù)分裂停滯在Ⅱ期中期;此外，還可觀察到胚胎極性的逆轉(zhuǎn)。既往研究認為，Rbx2-CUL-5 based E3泛素連接酶復(fù)合體中CUL-5或Rbx-2均不是生長發(fā)育所必須的。而隨后對CUL-5功能的進一步研究發(fā)現(xiàn)，CUL-5和CUL-2之間有復(fù)雜的相互關(guān)系，野生型線蟲可產(chǎn)生約300個卵，CUL-5完全敲除的線蟲卵的產(chǎn)生不受影響，CUL-2完全敲除后僅產(chǎn)生約50個卵;而CUL-2完全敲除后用RNAi部分干擾掉CUL-5或者Rbx-2后線蟲表現(xiàn)為完全不育，但CUL-5和CUL-2之間的相互作用的具體機制尚不清楚［14］。對于黑腹果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，CUL-2、CUL-5與卵巢的發(fā)育有關(guān)，CUL-2在所有的生殖系細胞中廣泛表達，CUL-2缺失后表現(xiàn)為多種發(fā)育缺陷主要是生殖細胞的減少和滋養(yǎng)細胞的變性，而CUL-5缺失后也觀察到了相似的表型［15］。目前還未有CUL-2或CUL-5在人卵發(fā)生和成熟中功能的報道，或許人類卵子異常導(dǎo)致的不孕患者中可能存在CUL-2或CUL-5基因表達的異常。

CUL-5與卵巢異常囊樣表型 成熟的果蠅卵母細胞源于被稱為卵室的前體結(jié)構(gòu)，每個卵室含有16個相互連接的包囊細胞，其外由卵泡上皮包被可形成包囊。僅1個包囊細胞進入減數(shù)分裂并發(fā)育為卵細胞，而另外15個變?yōu)樽甜B(yǎng)細胞［16］。當CUL-5發(fā)生基因突變時，卵室表現(xiàn)為異常增大的囊樣結(jié)構(gòu)，原因是生殖細胞的過度增殖和外面包被的卵巢上皮細胞分隔形成異常。卵室中的生殖細胞均多于16個，可達幾十個。正常情況下，卵巢上皮細胞僅包被1個包囊細胞形成1個包囊，而CUL-5突變后，卵巢上皮細胞無法正常遷移至兩個包囊之間，導(dǎo)致出現(xiàn)多個包囊細胞被包被在同一層上皮內(nèi)［17］。在人類中，多囊卵巢綜合征 (polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者表現(xiàn)為卵巢多囊樣外觀，其多囊形成的機制仍未完全闡明，雖然人和動物之間的生理結(jié)構(gòu)、疾病譜和其相應(yīng)的病理生理過程都有很大差異，但來源于模式生物的研究結(jié)果具有一定的提示作用，將來或許有CRLs家族與PCOS發(fā)生發(fā)展的研究被報道。

CUL-3

對生殖系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，CUL-3與精子發(fā)生、雄性不育密切相關(guān)。在小鼠中，CUL-3可在小鼠多種組織中表達，但主要分布于睪丸［18］，提示CUL-3的表達有一定的空間特異性。原位雜交在小鼠精子發(fā)育的各個階段均檢測到CUL-3 mRNA的表達，而僅在精子發(fā)生的后期有CUL-3蛋白表達。根據(jù)CUL-3的時間和空間表達譜，不難推斷CUL3-based E3類泛素酶與精子的晚期發(fā)生有關(guān)，其表達的異?？赡芤鹦坌圆挥?。而且，在果蠅中的研究［19］也支持這一推論，不管是昆蟲還是哺乳動物，精子發(fā)生的最后階段都存在大量細胞質(zhì)的丟失，在果蠅體內(nèi)，這一過程需要凋亡蛋白caspase介導(dǎo)的細胞重構(gòu)，研究證實CUL-3復(fù)合物可通過激活caspase而在果蠅精子發(fā)生的后期發(fā)揮重要作用。

CUL-4

在人體內(nèi)主要包括兩種CUL-4基因，即CUL-4A和CUL-4B，CUL-4B突變可引起X連鎖智力低下［20］，表現(xiàn)為生長遲滯、軀干肥胖、巨頭畸形、共濟失調(diào)、震顫、性功能低下和男性乳房女性化，未有和人類疾病相關(guān)的CUL-4A的突變報道。目前在生殖系統(tǒng)中的研究表明，CUL-4主要是和雄性不育、性激素受體降解相關(guān)。

CUL-4A與雄性不育 CUL-4A敲除 (第4～8外顯子敲除)的雄性小鼠不育和精子發(fā)生受阻［21-22］，表現(xiàn)為精子數(shù)目減少、活動力減弱及頂體產(chǎn)生異常。在精子發(fā)生過程中，CUL-4A-/-小鼠雙線期的精子中，晚期重組相關(guān)的分子MLH1異常降解，而使隨后的減數(shù)分裂Ⅱ期無法進行。較為有趣的是，CUL-4A第4-8外顯子敲除的雌鼠可以懷孕并產(chǎn)下活仔，僅生育力輕度受損，可能原因為CUL-4A敲除后，CUL-4B可代償其功能，而CUL-4B是X連鎖的，所以雌雄有差異。

CUL-4A與胚胎發(fā)育 CUL-4A敲除 (第1外顯子敲除)小鼠無存活的后代產(chǎn)生。性交后7.5 d(7.5 dpc)CUL-4A-/-胚胎已死亡，而4.5 dpc純合突變的囊胚泡可存活，推測CUL-4A-/-胚胎在4.5～7.5 dpc之間死亡，因此認為CUL-4A與胚胎早期發(fā)育相關(guān)［23］。但是近年來此理論受到了質(zhì)疑，因為CUL-4A基因敲除小鼠模型構(gòu)建方式的不同而出現(xiàn)的結(jié)果不同，敲除CUL-4A外顯子1后胚胎期致死，敲除外顯子17～19無表型，敲除外顯子4～8僅有小鼠胚胎纖維母細胞增殖有輕度上升。所以，CUL-4A在胚胎發(fā)育中的功能需要進一步探究。

CUL-4B與雄激素不敏感 關(guān)于CUL-4B和激素關(guān)系的研究較少，近期研究發(fā)現(xiàn)CUL-4B可以和芳香烴受體 (aryl hydrocarbon receptor，AhR)組成新復(fù)合物，特異性識別底物雌激素受體和雄激素受體，并介導(dǎo)其降解［24］。雄激素受體的異常和多種雄激素不敏感的疾病發(fā)生相關(guān)［25］，如抗雄激素綜合征或者睪丸女性化，表現(xiàn)為女性外觀，但是無子宮和輸卵管，生殖腺為睪丸。Reifenstein綜合征也存在雄激素受體功能缺陷引起的雄激素不敏感現(xiàn)象，臨床表現(xiàn)為男性外觀、泌尿生殖發(fā)育異常、生殖器女性化。CUL-4B可介導(dǎo)雄激素受體的降解，推測和雄激素不敏感的臨床疾病可能有相關(guān)關(guān)系。

CUL-7

CUL-7在生長發(fā)育、細胞轉(zhuǎn)化和p53調(diào)節(jié)等方面的作用已有較為詳細的綜述［25］。CUL-7是較晚開始研究的E3泛素酶，其在生殖系統(tǒng)中的作用涉及較少。CUL-7的作用底物胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)是重要的胰島素信號通路分子，CUL-7缺乏可引起胰島素信號途徑異常而出現(xiàn)生長發(fā)育缺陷［26］。此外，IRS-1絲氨酸的磷酸化等可引起信號向下游PI3K通路的傳導(dǎo)受阻，進而導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素抵抗與多種代謝紊亂的疾病的發(fā)生相關(guān)，如PCOS。PCOS是一類病因復(fù)雜的代謝紊亂疾病，臨床特點是高雄激素表現(xiàn)、卵巢多囊樣變、稀發(fā)排卵，可有糖代謝紊亂、脂代謝紊亂并可伴有心血管疾病、婦科腫瘤等長期并發(fā)癥。胰島素抵抗是其最重要的病理生理機制之一，已有研究證實，IRS-1與PCOS中的胰島素抵抗相關(guān)［27-28］，因此推測CUL-7-IRS-1調(diào)節(jié)通路可能與PCOS相關(guān)，CUL-7基因突變或表觀遺傳學(xué)修飾的改變可能通過調(diào)節(jié)IRS-1蛋白功能從而影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。

總之，Culling蛋白是CRLs家族重要的組成部分，在生殖系統(tǒng)正常功能的維持中扮演重要角色，與婦科腫瘤、生殖與不育、婦科內(nèi)分泌疾病有一定的相關(guān)性，對于POF、PCOS等病因復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展機制有一定提示作用。但目前多數(shù)研究僅局限在動物模型層面上，真正的臨床研究較少，很多源于模式動物的結(jié)論和推論有待進一步證實。相信隨著CRLs復(fù)合物結(jié)構(gòu)的闡明、新的作用底物的發(fā)現(xiàn)以及臨床研究的進一步深入，其在生殖系統(tǒng)及其相關(guān)疾病中的作用也會逐漸明確。

［1］Jackson S，Xiong Y.CRL4s:the CUL4-RING E3 ubiquitin ligases ［J］.Trends Biochem Sci，2009，34(11):562-570.

［2］Bosu DR，Kipreos ET.Cullin-RING ubiquitin ligases:global regulation and activation cycles［J］.Cell Div，2008，3:7.

［3］Angers S，Li T，Yi X，et al.Molecular architecture and assembly of the DDB1-CUL4A ubiquitin ligase machinery ［J］.Nature，2006，443(7111):590-593.

［4］Kanarek N，Horwitz E，Mayan I，et al.Spermatogenesis rescue in a mouse deficient for the ubiquitin ligase SCF{beta}-TrCP by single substrate depletion ［J］.Genes Dev，2010，24(5):470-477.

［5］Setoyama D，Yamashita M，Sagata N，et al.Mechanism of degradation of CPEB during Xenopus oocyte maturation ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(46):18001-18006.

［6］Fotovati A，Abu-Ali S，Nakayama K，et al.Impaired ovarian development and reduced fertility in female mice deficient in Skp2 ［J］.J Anat，2011，218(6):668-677.

［7］Pennetier S，Uzbekova S，Guyader-Joly C，et al.Genes preferentially expressed in bovine oocytes revealed by subtractive and suppressive hybridization ［J］.Biol Reprod，2005，73(4):713-720.

［8］Dealy MJ，Nguyen KV，Lo J，et al.Loss of Cul1 results in early embryonic lethality and dysregulation of cyclin E ［J］.Nat Genet，1999，23(2):245-248.

［9］Wang Y，Penfold S，Tang X，et al.Deletion of the Cul1 gene in mice causes arrest in early embryogenesis and accumulation of cyclin E ［J］.Curr Biol，1999，9(20):1191-1194.

［10］Kim JY，Lim SJ，Kim HJ，et al.Clinical significance of p27 and Skp2 protein expression in uterine cervical neoplasm［J］.Int J Gynecol Pathol，2007，26(3):242-247.

［11］Kamata Y，Watanabe J，Nishimura Y，et al.High expression of skp2 correlates with poor prognosis in endometrial endometrioid adenocarcinoma ［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2005，131(9):591-596.

［12］Sui L，Dong Y，Watanabe Y，et al.Clinical significance of Skp2 expression，alone and combined with Jab1 and p27 in epithelial ovarian tumors［J］.Oncol Rep，2006，15(4):765-771.

［13］Liu J，Vasudevan S，Kipreos ET，et al.CUL-2 and ZYG-11 promote meiotic anaphase II and the proper placement of the anterior-posterior axis in C.elegans ［J］.Development，2004，131(15):3513-3525.

［14］Sasagawa Y，Sato S，et al.C.elegans RBX-2-CUL-5-and RBX-1-CUL-2-based complexes are redundant for oogenesis and activation of the MAP kinase MPK-1 ［J］.FEBS Lett，2007，581(1):145-150.

［15］Ayyub C.Cullin-5 and cullin-2 play a role in the development of neuromuscular junction and the female germ line of Drosophila ［J］.J Genet，2011，90(2):239-249.

［16］張宜茂，趙德標.果蠅卵子發(fā)生的分子生物學(xué) ［J］.細胞生物學(xué)雜志，1997，19(1):9-18.

［17］Kugler JM，Lem C，Lasko P，et al.Reduced cul-5 activity causes aberrant follicular morphogenesis and germ cell loss in Drosophila oogenesis ［J］.PLoS One，2010，5(2):e9048.

［18］Wang S，Zheng H，Esaki Y，et al.Cullin3 is a KLHL10-interacting protein preferentially expressed during late spermiogenesis［J］.Biol Reprod，2006，74(1):102-108.

［19］Arama E，Bader M，Rieckhof GE，et al.A ubiquitin ligase complex regulates caspase activation during sperm differentiation in Drosophila ［J］.PLoS Biol，2007，5(10):e251.

［20］Zou Y，Liu Q，Chen B，et al.Mutation in CUL4B，which encodes a member of cullin-RING ubiquitin ligase complex，causes X-linked mental retardation ［J］.Am J Hum Genet，2007，80(3):561-566.

［21］Kopanja D，Roy N，Stoyanova T，et al.Cul4A is essential for spermatogenesis and male fertility ［J］.Dev Biol，2011，352(2):278-287.

［22］Yin Y，Lin C，Kim ST，et al.The E3 ubiquitin ligase Cullin 4A regulates meiotic progression in mouse spermatogenesis［J］.Dev Biol，2011，356(1):51-62.

［23］Li B，Ruiz JC，Chun KT，et al.CUL-4A is critical for early embryonic development ［J］.Mol Cell Biol，2002，22(14):4997-5005.

［24］Ohtake F，Baba A，Takada I，et al.Dioxin receptor is a ligand-dependent E3 ubiquitin ligase ［J］.Nature，2007，446(7135):562-566.

［25］郭曉強，貢樹基，姜紅.Cullin 7:一種多功能的泛素連接酶亞基 ［J］.生命的化學(xué)，2010，30(6):898-901.

［26］Xu X，Sarikas A，Dias-Santagata DC，et al.The CUL7 E3 ubiquitin ligase targets insulin receptor substrate 1 for ubiquitin-dependent degradation ［J］.Mol Cell，2008，30(4):403-414.

［27］Allemand MC，Irving BA，Asmann YW，et al.Effect of testosterone on insulin stimulated IRS1 Ser phosphorylation in primary rat myotubes—a potential model for PCOS-related insulin resistance ［J］.PLoS One，2009，4(1):e4274.

［28］Dilek S，Ertunc D，Tok EC，et al.Association of Gly972Arg variant of insulin receptor substrate-1 with metabolic features in women with polycystic ovary syndrome ［J］.Fertil Steril，2005，84(2):407-412.