于慧杰 李峰生 何 蕊 江其生 (第二炮兵總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 10088)

腫瘤免疫治療可針對(duì)特定的抗原激發(fā)體內(nèi)的免疫應(yīng)答來提高免疫能力，破壞腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸功能，殺傷或殺滅腫瘤細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞、組織，提高腫瘤患者的生存率以及提高生活質(zhì)量。如何打破腫瘤的免疫耐受、激活機(jī)體免疫來殺傷腫瘤，是當(dāng)前腫瘤免疫治療研究的主要方向。而樹突狀細(xì)胞(DC)來源exosomes(Dex)能激活先天性和獲得性免疫啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答［1，2］。因此Dex作為一種新型非細(xì)胞疫苗應(yīng)用于腫瘤免疫治療得到廣泛關(guān)注。

1 Exosomes的概念及Dex的特征

最近幾年exosomes生物學(xué)研究呈指數(shù)上升。Exosomes的簡(jiǎn)明概念是活細(xì)胞分泌到附近液體的納米粒，在蔗糖溶液中密度為1．12～1．20 g/ml。他們是包含有核酸和蛋白質(zhì)的小囊泡(30～120 nm)，在機(jī)體部位間運(yùn)輸這些物質(zhì)。樹突狀細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分泌的exosemes及其他不同來源exosomes的大規(guī)模蛋白分析證實(shí)exosomes是一種特異的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)而不是隨機(jī)細(xì)胞碎片［3-5］。Exosomes包含其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體)有限數(shù)量的蛋白，明顯不同于由凋亡細(xì)胞釋放的膜囊泡［3］。除了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，exosomes的蛋白和脂質(zhì)成分也很獨(dú)特，可用于鑒定他們的附加性狀。因?yàn)樗麄儊碓从诎麅?nèi)體，所有的exosomes包含膜轉(zhuǎn)運(yùn)和溶解蛋白(GTPases，Annexins，flotillin)、tetraspannins(CD9，CD63，CD81，CD82)、熱休克蛋白(Hsp70，Hsp90)、多泡體生源包含蛋白 (Alix，TSG101)、脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶類［6，7］。雖然這些蛋白常規(guī)可作為陽(yáng)性標(biāo)記物，但是不同來源exosomes有很大的不同。

Dex含有豐富的MHCⅠ、Ⅱ和CD86等重要的免疫分子，因此在體內(nèi)能刺激T細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生有效的免疫刺激，在體內(nèi)能引起有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答［8］。有研究表明Dex調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答是通過直接暴露MHC和共刺激分子或通過間接轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)部成分環(huán)繞細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的［9］。Dex能轉(zhuǎn)移功能性MHCⅠ和MHCⅡ/肽復(fù)合物到DC分別啟動(dòng) CD8+和CD4+T 細(xì)胞［10-12］。Montecalvo 等［13］在《Blood》雜志報(bào)道Dex負(fù)載不同系列microRNA，這依賴于DC活化狀態(tài)，他們報(bào)道Dex能與靶細(xì)胞融合，然后傳遞膜和胞漿內(nèi)容物。最后在靶細(xì)胞中被exosomes轉(zhuǎn)移的microRNA能抑制mRNA。

2 Exosomes的分離和鑒定

最嚴(yán)格的exosomes分離方法是:樣本液經(jīng)一系列低速旋轉(zhuǎn)洗滌后超速離心，離心力100 000～110 000×g，重懸，沉淀，這因?yàn)橐彩亲畛Ｓ玫姆椒?。純化?zhǔn)備前，因?yàn)閑xosomes懸浮在密度1．13～1.19 g/ml蔗糖溶液中，一些研究者用蔗糖墊和密度梯度離心法。經(jīng)抗體親和純化可特異性分離exosomes，抗體可以固定到各種介質(zhì)，包括磁珠、色譜矩陣、平板和微流體。也可以使用其他親和獲取方法如凝集素，他可以結(jié)合到exosomes表面特異糖殘基上。因?yàn)閑xosomes小于130 nm，低于光鏡分辨率，所以用電鏡鑒定exosomes?；诳贵w的技術(shù)可以檢測(cè)exosomes，如 Western blot或 ELISA等，可快速鑒定 exosomes［14］。

2002 年 Théry 等［3，4］利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)Dex的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，用免疫電鏡技術(shù)和流式細(xì)胞儀定位和驗(yàn)證，鑒定出21個(gè)新exosomes蛋白，首次繪制出一個(gè)比較完整的Dex蛋白圖譜，還根據(jù)這些蛋白質(zhì)的潛在功能描繪了一幅其蛋白功能的解析圖。Lamparski等［15］從單核細(xì)胞來源的DC中制備了臨床級(jí)exosomes并已應(yīng)用于臨床Ⅰ期和Ⅱ期試驗(yàn)，同時(shí)他們通過流式細(xì)胞儀測(cè)定MHCⅡ類分子的數(shù)量和表型特征，完善了exosomes數(shù)量的測(cè)量和質(zhì)控方法。

3 Dex誘導(dǎo)作用的雙重性

Dex激活T細(xì)胞的結(jié)果依賴分泌exosomes細(xì)胞的生理狀態(tài)。例如成熟DC比不成熟DC分泌的exosomes更有效誘導(dǎo)T細(xì)胞體外活化，誘導(dǎo)體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞和抗體應(yīng)答［1，16］。這種免疫效應(yīng)能被利用，比如抗腫瘤治療［17］。相反，不成熟DC分泌的Dex只有結(jié)合佐劑或預(yù)負(fù)載到接受者DC才能誘導(dǎo)有效抗腫瘤應(yīng)答［12，13］。而當(dāng)將未成熟 DC 分泌的 Dex、或免疫抑制處理的DC分泌的Dex或者為表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子而進(jìn)行基因修飾的DC分泌的Dex單獨(dú)注射時(shí)，反而能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答耐受，可用于自體免疫疾病治療［18，19］。

4 Dex抗腫瘤免疫治療

Zitvogel等［20］1998年首次應(yīng)用負(fù)載腫瘤抗原的DC釋放的Dex免疫小鼠，成功使荷瘤小鼠的腫瘤消退。研究人員用各種不同腫瘤洗脫的肽酸沖擊Dex，小鼠模型中Dex以MHC-和CD8+T細(xì)胞依賴途徑延緩腫瘤生長(zhǎng)。DC經(jīng)遞呈MHCⅠ肽復(fù)合物到幼稚T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答。他們報(bào)道Dex產(chǎn)生功能性MHCⅠ-肽復(fù)合物，在小鼠體內(nèi)促進(jìn)誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫應(yīng)答。這些結(jié)果為Dex在細(xì)胞內(nèi)通訊中至少是在免疫系統(tǒng)中起重要作用的假設(shè)提供基礎(chǔ)，促進(jìn)臨床上首次嘗試應(yīng)用Dex作為人體新型抗腫瘤治療方法，Ⅰ期試驗(yàn)在1999到2002年，Ⅱ期試驗(yàn)正在法國(guó)進(jìn)行［21］。

張?jiān)谠频龋?2］用腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載DC提取Dex顯示有CEA表達(dá)，表明exosome含有腫瘤抗原。用Dex刺激活化的T細(xì)胞對(duì)A549肺癌細(xì)胞有明顯殺傷作用，負(fù)載組殺傷率明顯高于DC組和未負(fù)載組，表明經(jīng)肺癌細(xì)胞裂解物負(fù)載DC分泌的Dex能有效誘導(dǎo)抗腫瘤作用。用腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載DC制備Dex疫苗，方法簡(jiǎn)單方便，效力強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。

至今為止，很少有臨床試驗(yàn)評(píng)估患者接種非細(xì)胞疫苗exosomes的有效性，這些試驗(yàn)都在晚期患者中完成［23-25］。但最近報(bào)道DC疫苗治療前列腺癌使免疫治療重新受到關(guān)注［26］。Escudier等［24］證明了GLP放大和擴(kuò)增純化臨床級(jí)Dex的可行性，觀察到15例黑色素瘤患者NK細(xì)胞修復(fù)數(shù)量和NKG2D依賴功能，沒有Ⅱ級(jí)毒性和最大耐受劑量——說明exosomes注射的安全性。此外Morse等［25］研究13例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者報(bào)道Dex能誘導(dǎo)MAGE特異T細(xì)胞應(yīng)答，增強(qiáng)NK溶解活性。Ⅰ期臨床試驗(yàn)報(bào)道Dex用于晚期腫瘤患者可行、耐受性良好。

由于發(fā)現(xiàn)DC成熟狀態(tài)能影響Dex免疫性質(zhì)，研究生成第二代Dex(由IFN-γ處理的DCs)可提高免疫性質(zhì)［17］。IFN-γ是單個(gè)核細(xì)胞來源DC適合的成熟劑，誘導(dǎo) Dex上 CD40、CD80、CD86和 CD54表達(dá)，生成免疫原性Dex。Dex疫苗質(zhì)量確實(shí)從三方面得到改善。從前生成的 exosomes:(1)低表達(dá)CD40、CD86和 ICAM-1分子，這些分子對(duì)于激活T細(xì)胞和/或DC/T細(xì)胞相互作用很重要［16］。(2)在臨床前試驗(yàn)中需要轉(zhuǎn)移到宿主APC來誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。(3)需要直接用MHCⅠ類分子酸洗脫后肽沖擊exosomes。而新過程應(yīng)用IFN-γ使DC成熟生成免疫原性Dex，可以顯著富集共刺激因子和ICAM-1粘附分子，體外克隆CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，體內(nèi)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞。

Ⅱ期臨床試驗(yàn)中評(píng)估Dex維持性免疫治療的臨床效果，試驗(yàn)對(duì)象為不宜手術(shù)的ⅢB/Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)化療后應(yīng)答或穩(wěn)定患者，2009年11月開始在Gustave Roussy和 Curie研究所進(jìn)行。從HLA-DP*04-限制性肽:(MAGE-3)和HLA-A*02-限制性肽(NY-ESO-1，MAGE-1，MAGE-3，MART-1)負(fù)載的自體成熟MD-DC中純化Dex?；颊呤紫冉邮?次鉑類藥物化療。臨床前和臨床數(shù)據(jù)說明環(huán)磷酰胺促進(jìn)晚期患者Dex介導(dǎo)的T細(xì)胞生成并且修復(fù)T-和 NK-細(xì)胞功能［27，28］。HLA-A*02 有效者適合誘導(dǎo)免疫治療，他們需要口服3周低劑量環(huán)磷酰胺然后皮內(nèi)注射Dex每周一次，共四次［28］。繼續(xù)Dex疫苗免疫治療6周，每2周一次。2009年11月到2011年12月共招募41例患者，最主要目的是為了改善4個(gè)月化療后無進(jìn)展生存期。第二個(gè)目的是評(píng)估Dex的臨床效應(yīng)(評(píng)估總體存活期、客觀緩解率)、生物標(biāo)記有效性(NK活化、NKG2D表達(dá)修復(fù)、肽疫苗特異性T細(xì)胞應(yīng)答)和成熟Dex安全性［29］。

Dex能直接觸發(fā)小鼠和腫瘤患者中NK細(xì)胞活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓來源或單個(gè)核細(xì)胞來源DC分泌的Dex包含功能性膜結(jié)合NKG2D配體和IL-15Rα。試驗(yàn)表明GMP生產(chǎn)的Dex在體外和患者體內(nèi)能觸發(fā)NK細(xì)胞增殖和活化。臨床Ⅰ期研究表明Dex疫苗能顯著增強(qiáng)大多數(shù)晚期黑色素瘤患者循環(huán)NK細(xì)胞數(shù)量和NKG2D依賴功能。15例患者接受每周1次共4次接種，第一次接種Dex后第1周和第7周評(píng)估T和NK細(xì)胞功能。Dex治療淋巴細(xì)胞池保存穩(wěn)定，治療后CD3－/CD56+NK細(xì)胞/mm3比例和數(shù)量增加。晚期黑色素瘤患者NK細(xì)胞表型研究顯示，與正常受試者相比在Dex接種前NKG2D水平顯著降低(36%±22%)，但4次注射Dex疫苗后顯著升高(61%±28%)。為了評(píng)估觀察結(jié)果功能相關(guān)性，又進(jìn)行了血液中NK細(xì)胞對(duì)K 562這種NKG2D配體表達(dá)靶細(xì)胞的殺傷活性試驗(yàn)。4次接種后7/14患者NKG2D表達(dá)水平≥70%，這些患者中受抑制的K562特異性細(xì)胞毒性恢復(fù)到正常水平。未應(yīng)答者(如患者Dex未修復(fù)NKG2D表達(dá))對(duì)K562殺傷活性相對(duì)較低。2例患者腫瘤退縮，繼續(xù)治療(Dex注射每3周一次持續(xù)6～10個(gè)月)，NK細(xì)胞效應(yīng)功能隨時(shí)間推移而升高。Dex治療能上調(diào)6/14患者中CD8+T細(xì)胞NKF2D表達(dá)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明接種Dex疫苗黑色素瘤患者可修復(fù)依賴NKG2D的NK細(xì)胞功能，循環(huán)中NK細(xì)胞比例及數(shù)量增加，修復(fù)了循環(huán)T和NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)水平，刺激MHC非限制性NKG2D依賴細(xì)胞毒性［2］。

5 結(jié)語(yǔ)

Dex有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，能在－80℃冷凍保存6個(gè)月以上且維持表型和功能［29］。因?yàn)樗麄兪欠腔钚缘男∧遗?，所以他們有固定的生物化學(xué)本質(zhì)，在保存后不需要再擴(kuò)增可直接使用。Dex能替換或促進(jìn)其他免疫治療方法或作為維持性疫苗［14］。

Dex也存在一些問題，如制備費(fèi)用較大，Dex是來源于DC的小囊泡，所以需要符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的臨床細(xì)胞治療設(shè)備，需要熟練及有經(jīng)驗(yàn)的工作人員。此外，DC分化需要生長(zhǎng)因子和成熟因子使得過程費(fèi)用較大［30］。

Dex是穩(wěn)定的小囊泡，他包含特定蛋白和脂質(zhì)內(nèi)含物，可經(jīng)基因修飾和GMP標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系制成，具有可以冷凍儲(chǔ)藏、抗原性強(qiáng)、穩(wěn)定高效的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性使他們優(yōu)于所有活細(xì)胞，可以克服影響DC技術(shù)發(fā)展的一些缺陷，在實(shí)際使用中的可控性、可操作性和可推廣性都比較好。但仍需要進(jìn)一步觀察Dex瘤苗在不同腫瘤免疫治療中的效果和副作用，雖然已經(jīng)開展了Dex的臨床應(yīng)用研究，但其劑量和路徑、發(fā)生機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)機(jī)理、免疫耐受、體內(nèi)注射后細(xì)胞攝取或藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等方面還需進(jìn)一步探討。

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