戴陽(yáng)朔，董 錚，李 魏，戴良英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128)

泛素—蛋白酶體途徑(ubiquitin－proteasome pathway，UPP)廣泛存在于真核生物中，主要包括泛素化系統(tǒng)和26S蛋白酶體系統(tǒng)兩部分。該途徑在維持細(xì)胞功能，細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，胚胎發(fā)育，激素響應(yīng)，抵御環(huán)境脅迫和衰老等方面發(fā)揮著重要的作用。在泛素化系統(tǒng)中，關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶(Ubiquitin－activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(Ubiquitin －conjugating enzyme，E2)和泛素連接酶(Ubiquitinprotein ligase，E3)。該系統(tǒng)對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和降解的平衡及維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常功能方面起著重要作用。該系統(tǒng)一個(gè)重要的特點(diǎn)就是E1s、E2s、E3s的數(shù)量存在很大的差異。在擬南芥中，約1 400個(gè)基因(占總蛋白質(zhì)數(shù)量的5%左右)編碼泛素化系統(tǒng)的組分，其中E1基因只有2個(gè);E2基因有37個(gè)，E2－like基因8個(gè);E3基因超過1 400個(gè)［1］。在水稻中E1基因有6個(gè)，E2及 E2－like基因有49個(gè)，而E3基因則超過1 300個(gè)［2］。這可能主要是由于在泛素化系統(tǒng)中，E3的功能主要是特異性地識(shí)別不同的泛素化底物。近年來，擬南芥中E3在調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)逆境脅迫等方面的研究取得較大進(jìn)展，而E3在水稻中的研究盡管也取得了一定進(jìn)展，但相對(duì)緩慢。本文在簡(jiǎn)單概述泛素E3連接酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，主要對(duì)近年來水稻中E3連接酶介導(dǎo)的生物學(xué)功能進(jìn)行綜述。

1 E3泛素連接酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分類

E3泛素連接酶是一個(gè)超大的蛋白家族，其在整個(gè)泛素蛋白質(zhì)降解途徑中決定底物特異性的部分。根據(jù)E3的結(jié)構(gòu)組成，它可以分為單亞基E3和多亞基 E3 兩大類［3］。

單亞基的E3主要有兩類:一類含有HECT(homologous to the E6－AP carboxyl terminus)結(jié)構(gòu)域，一類含有RING/U－box結(jié)構(gòu)域［4］。HECT結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)約350個(gè)氨基酸殘基，N端與E2結(jié)合，距C端約30個(gè)氨基酸殘基處有一個(gè)與泛素形成硫脂鍵的半胱氨酸位點(diǎn)［5］。含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3廣泛存在于植物中，但在水稻中目前還沒有對(duì)其功能研究的報(bào)道。單亞基RING型E3是一類含有RING－finger結(jié)構(gòu)域的蛋白。RING finger結(jié)構(gòu)域是指70個(gè)氨基酸中由半胱氨酸(C)和組氨酸(H)組成的8個(gè)氨基酸通過與鋅離子螯合作用形成C3H2C3(RINGH2)或 C3H1C4(RING － HC)構(gòu)型［6］。U －box結(jié)構(gòu)域則是通過靜電的作用形成一種與RING finger結(jié)構(gòu)域類似的構(gòu)型，使得其結(jié)構(gòu)比RING finger結(jié)構(gòu)域更保守和穩(wěn)定［7］。兩者由于結(jié)構(gòu)上相似，在泛素蛋白質(zhì)降解途徑中起著類似的功能。

多亞基的E3主要有APC(Anaphase Promoting Complex)、SCF(Skp－Cullin－F－box)和 VBC(VCB－Cul2 complex)復(fù)合體，它們都含有一個(gè)支架蛋白Cullin(或Cullin－like)和一個(gè)RING－finger蛋白。在植物中研究得比較深入的主要是SCF復(fù)合體，例如 SCFTIR1、SCFCOI1、SCFEBF1/EBF2［8～10］等。SCF 復(fù)合體包含SKP1、Cullin和F－box三個(gè)蛋白，SCF與一個(gè)有RING－finger結(jié)構(gòu)域的蛋白和一個(gè)小分子蛋白R(shí)UB1共同作用組成E3［11］。在SCF復(fù)合體中，Cullin作為支架蛋白結(jié)合RING－finger蛋白和連接蛋白SKP1，SKP1則結(jié)合一系列具有底物特異識(shí)別功能的F－box蛋白［12，13］。隨著越來越多的新型 E3被發(fā)現(xiàn)，理解其功能發(fā)揮的作用機(jī)制已成為當(dāng)今研究的重要方向。

2 水稻中單亞基RING E3的生物學(xué)功能

在真核生物中，RING－finger蛋白是一個(gè)龐大的家族，大部分具有E3連接酶的活性。RING－finger蛋白被認(rèn)為在介導(dǎo)泛素轉(zhuǎn)移特異性底物方面具有重要作用，參與各種翻譯后調(diào)節(jié)過程，如蛋白降解、蛋白功能和結(jié)構(gòu)改變、蛋白定位變換等［6］。單亞基RING E3的RING －finger結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合E2，其他的結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)結(jié)合靶標(biāo)蛋白和一些其它的輔助因子。在植物中，如模式植物水稻和擬南芥中，已知的RING－finger蛋白分別至少有425和469個(gè)［14］。目前水稻中已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的E3以單亞基RING型居多，這些已發(fā)現(xiàn)的單亞基RING E3在水稻的抗病、抗非生物脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育等方面起重要的作用。

2.1 單亞基RING E3介導(dǎo)的水稻抗病反應(yīng)

Xb3是水稻白葉枯病正調(diào)控因子Xa21的一個(gè)互作蛋白，其 N端含有8個(gè)重復(fù)的錨蛋白結(jié)構(gòu)域［15］，C端含有1個(gè) RING －finger基序，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)的功能分別是與Xa21激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合和發(fā)揮E3泛素連接酶活性。Xa21蛋白不是通過Xb3的泛素化途徑降解，Xb3對(duì)于維持 Xa21蛋白穩(wěn)定性和Xa21介導(dǎo)的抗病反應(yīng)是必需的。當(dāng)病原菌侵染的時(shí)候，Xb3與Xa21形成復(fù)合體通過磷酸化作用將Xb3激活，被激活的Xb3可能通過泛素化降解抗病反應(yīng)中負(fù)調(diào)控因子，從而激活下游的抗病信號(hào)蛋白。

OsBBI1是一個(gè)表達(dá)受稻瘟病菌(Magnaporthe Oryzae)誘導(dǎo)的 RING－finger類型 E3泛素連接酶［16］。OsBBI1正調(diào)控稻瘟病抗性反應(yīng)，OsBBI1過表達(dá)植株提高了對(duì)稻瘟病的抗性。在接種稻瘟病菌后，OsBBI1過表達(dá)植株的葉鞘表皮細(xì)胞壁厚度比對(duì)照大，細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)量上升，說明OsBBI1可能通過改變細(xì)胞壁抗性反應(yīng)在抗稻瘟病過程中起作用。

2.2 單亞基RING E3介導(dǎo)的水稻非生物脅迫反應(yīng)

OsDSG1是一個(gè)從種子延遲萌發(fā)的T－DNA突變體群體中鑒定出來的RING－finger類型E3泛素連接酶［17］。與野生型相比較，除了延遲種子萌發(fā)外，osdsg1突變體對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)。在osdsg1突變體中，一系列ABA信號(hào)途徑基因和ABA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，說明OsDSG1可能是依賴于ABA信號(hào)途徑來負(fù)調(diào)控干旱和高鹽等逆境脅迫響應(yīng)過程。

OsDIS1是從干旱處理的水稻芯片數(shù)據(jù)中分離出來的RING－finger類型E3泛素連接酶。相比對(duì)照，OsDIS1過表達(dá)削弱了水稻對(duì)干旱的抗性，而該基因的RNA干擾卻增強(qiáng)了水稻對(duì)干旱的抗性。在正常和干旱條件下，OsDIS1過表達(dá)植株中大量逆境脅迫應(yīng)答基因和調(diào)節(jié)因子被誘導(dǎo)或抑制表達(dá)［18］。此外OsDIS1與OsNek6存在相互作用，且OsDIS1可在體外泛素化OsNek6［19］。說明OsDIS1可能通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控一系列逆境相關(guān)基因的表達(dá)，及翻譯后修飾OsNek6來負(fù)調(diào)控水稻的干旱脅迫響應(yīng)過程。

水稻OsSDIR1是擬南芥ABA信號(hào)正調(diào)控因子SDIR1的同源蛋白，是一個(gè)RING－finger類型的E3泛素連接酶［20］。OsSDIR1能夠互補(bǔ)擬南芥sidr1突變體對(duì)干旱敏感的表型，且過表達(dá)OsSDIR1的擬南芥植株對(duì)ABA更加敏感。與對(duì)照相比，干旱處理下過表達(dá)OsSDIR1的水稻植株中氣孔關(guān)閉的比例增加，葉片失水速率減慢，表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱耐受性。說明OsSDIR1可能與SDIR1相似，通過介導(dǎo)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正調(diào)控水稻干旱脅迫響應(yīng)過程。

Rma1H1是辣椒中一個(gè)RING－finger類型的泛素E3連接酶，通過泛素化修飾水通道蛋白PIP2;1，正調(diào)控植物干旱脅迫反應(yīng)［21］。Bae等［22］采用同源克隆的方法分離出Rma1H1在水稻中的一個(gè)同源基因OsRDCP1，該基因也編碼一個(gè)RING－finger類型的泛素E3連接酶。與對(duì)照相比，OsRDCP1過表達(dá)植株在嚴(yán)重干旱的情況下表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱耐受性，說明OsRDCP1蛋白是一個(gè)水稻干旱脅迫響應(yīng)過程正調(diào)控因子。

2.3 單亞基RING E3介導(dǎo)的水稻其他生物學(xué)過程

GW2是通過圖位克隆的方法得到的一個(gè)影響稻谷的粒寬和粒重的 QTL［23］。水稻品種 FAZ1中GW2蛋白含有425個(gè)氨基酸;而水稻品種WY3中GW2等位基因由于第4個(gè)外顯子上一個(gè)堿基的缺失，使其蛋白翻譯提前終止，編碼的產(chǎn)物只有115個(gè)氨基酸，缺失的部分為錨蛋白結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)等位基因都具有完整的RING－finger結(jié)構(gòu)域和E3泛素連接酶活性。與FAZ1相比，WY3由于GW2功能缺失使其底物不能被特異識(shí)別，進(jìn)而激活穎花外殼細(xì)胞的分裂，從而增加穎花外殼的寬度;另一方面，間接地提高了灌漿速率，胚乳的大小得到增加，最終使得粒寬和粒重增加，產(chǎn)量提高。這說明GW2通過負(fù)調(diào)控細(xì)胞的分裂控制水稻粒型及產(chǎn)量。

3 U－box類型E3介導(dǎo)的生物學(xué)過程

植物中廣泛存在 U－box基因，擬南芥中有64個(gè)U－box蛋白［24］，而水稻中有 77個(gè) U－box蛋白［25］。U－box蛋白構(gòu)象與RING－finger蛋白極其相似，兩者都能促進(jìn)底物蛋白泛素化降解，在細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的降解及質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)有一些報(bào)道證明U－box蛋白也在水稻抗非生物脅迫和抗病過程中發(fā)揮作用。

OsUPS是一個(gè)受磷饑餓誘導(dǎo)的U－box蛋白，在缺無機(jī)磷的條件下，水稻植株OsUPS表達(dá)水平上調(diào)［26］。自身泛素化實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)菌中表達(dá)的Os-UPS具有E3泛素連接酶活性，說明OsUPS可能通過泛素化反應(yīng)調(diào)控磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

Park等［27］鑒定了水稻細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一個(gè)具有E3泛素連接酶活性的U－box蛋白OsPUB15。OsPUB15的T－DNA突變體表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩，幼苗致死，種子不能產(chǎn)生初生根，莖的發(fā)育也顯著延遲，這些異常的表型能被兩種抗氧化劑兒茶素和維生素C部分恢復(fù)。與對(duì)照相比，突變體中過氧化氫和氧化蛋白的含量更高。在過氧化氫、鹽、干旱脅迫下，OsPUB15表達(dá)水平明顯升高，在高鹽條件下OsPUB15超表達(dá)植株長(zhǎng)勢(shì)比對(duì)照更好。說明PUB15可能通過減少活性氧脅迫正調(diào)控水稻逆境脅迫響應(yīng)過程。

Zeng等［28］利用圖位克隆技術(shù)分離了一個(gè)調(diào)控水稻開花期和細(xì)胞程序性死亡的基因Spl11，其編碼的SPL11蛋白具有E3泛素連接酶活性，該活性依賴于完整的U－box結(jié)構(gòu)域。spl11有一個(gè)單堿基替換，導(dǎo)致其編碼的SPL11蛋白過早終止，該基因突變后導(dǎo)致水稻開花期延遲和細(xì)胞程序死亡加速。VEGA－Sanchez等［29］采用酵母雙雜交篩選得到一個(gè)SPL11互作蛋白SPIN1，SPIN1是一個(gè)RNA/DNA結(jié)合蛋白。Spin1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出開花期延遲，是水稻開花期的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。泛素化實(shí)驗(yàn)表明SPL11單泛素化SPIN1，這說明SPL11可能通過單泛素化作用抑制SPIN1來促進(jìn)水稻開花。

4 水稻中SCF型E3介導(dǎo)的生物學(xué)過程

在擬南芥中，目前的研究發(fā)現(xiàn)很多SCF復(fù)合體涉及生長(zhǎng)發(fā)育等過程中關(guān)鍵步驟的控制，如SCFTIR1介導(dǎo)的生長(zhǎng)素反應(yīng)、SCFEBF1/EBF2介導(dǎo)的乙烯反應(yīng)、SCFCOI1介導(dǎo)的茉莉酸反應(yīng)等［6～8］。

而在水稻中，研究比較深入的則只有SCFGID2介導(dǎo)的赤霉素反應(yīng)。Sasaki［30］等通過對(duì)水稻GA不敏感矮化突變體的研究分離出蛋白GID1(GA－insensitive dwarf 1)以及和擬南芥SLY同源的F－box蛋白 GID2(GA－insensitivedwarf 2)。研究發(fā)現(xiàn)GID1是GA的信號(hào)受體，該蛋白通過GA與SLR1(Slender Rice 1)直接作用。GA誘導(dǎo)SLR1磷酸化，從而促進(jìn)GID2與磷酸化的SLR1直接相互作用，進(jìn)而使磷酸化的SLR1被SCFGID2復(fù)合體泛素化并通過26S 蛋白酶體降解［31］。

F－box蛋白是一類含有F－box結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員，是SCF復(fù)合體的重要組分。其N端有一段含60個(gè)氨基酸的F－box保守序列，該F－box結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合ASK/SKP。F－box蛋白C端部分可以是很多不同類型的蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)識(shí)別特異性底物和與底物相結(jié)合［32］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)－box蛋白在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程起著重要的作用。

OsFbx352是一個(gè)表達(dá)受ABA誘導(dǎo)的F－box基因，其轉(zhuǎn)錄水平會(huì)在種子吸漲后增加，而該增加過程明顯受到葡萄糖的抑制［33］。OsFbx352超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)受葡萄糖的抑制程度比對(duì)照要低，而OsFbx352的RNAi轉(zhuǎn)基因植株則比對(duì)照要高。在有葡萄糖存在下，過表達(dá)OsFbx352植株中ABA合成基因的表達(dá)降低，ABA代謝途徑相關(guān)基因上調(diào)。說明OsFbx352對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)下的抑制種子萌發(fā)起到調(diào)節(jié)作用，而這種調(diào)節(jié)作用是通過影響ABA代謝實(shí)現(xiàn)的。

Duan等［34］發(fā)現(xiàn)水稻中的一個(gè) F－box基因DDF1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸展影響器官大小。該基因的突變體表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育異常，除了小穗外所有器官均變小。研究發(fā)現(xiàn)DDF1正向調(diào)節(jié)B類基因OsMADS4和OsMADS16，負(fù)向調(diào)節(jié)雌蕊特化基因DL，這說明DDF1是調(diào)控水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和花器官特化的一個(gè)重要遺傳因子。

水稻LP基因編碼一個(gè)富含Kelch的F－box蛋白［35］。突變體lp表現(xiàn)出花枝梗變多，籽粒數(shù)增加。同時(shí)突變體較對(duì)照更抗倒伏，每株籽粒產(chǎn)量也相應(yīng)增加。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，突變體中的Os-CKX2(一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/去氧化酶的基因)表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。說明LP可能通過參與調(diào)控植物組織的細(xì)胞分裂素水平，從而調(diào)控水稻株型進(jìn)而提高水稻籽粒產(chǎn)量。

MAIF1是水稻中一個(gè)表達(dá)受到ABA和非生物脅迫迅速誘導(dǎo)的F－box基因［36］。過量表達(dá)MAIF1降低了水稻對(duì)ABA的敏感性和對(duì)非生物脅迫的耐受性，促進(jìn)根的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，MAIF1在調(diào)節(jié)水稻生長(zhǎng)過程中參與了多個(gè)信號(hào)途徑。由于限制植株的生長(zhǎng)是植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的一種策略，說明MAIF1可能通過控制根系生長(zhǎng)在應(yīng)對(duì)非生物脅迫過程中發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控作用。

5 研究展望

二十幾年前科學(xué)家從植物中發(fā)現(xiàn)了泛素蛋白酶體降解途徑［37］。近年來，科學(xué)家在水稻E3泛素連接酶的結(jié)構(gòu)和功能研究方面取得了一定的進(jìn)展，E3泛素連接酶參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育等方面的調(diào)控作用也漸漸清晰。但仍存在很多問題需要解決，例如，水稻中存在著大量的HECT型的E3，它們的功能是什么?水稻中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多RING型、U－Box型和SCF型E3連接酶，它們的底物蛋白是什么?它們是如何識(shí)別底物蛋白的?這些E3是如何被調(diào)控的?對(duì)這些問題的深入研究，將有助于進(jìn)一步揭示泛素化途徑調(diào)控水稻生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制。

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