高明娟(綜述)，劉遠梅(審校)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院小兒普胸泌外科，貴州遵義 563099)

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung＇s disease，HD)是小兒常見疾病，發(fā)病率高達1/2000－1/5000，最顯著病理生理變化是病變腸管神經(jīng)發(fā)育異?；虼_缺如，導致局部腸管痙攣和狹窄，腸蠕動喪失和內(nèi)括約肌松弛反射消失，隨著近端腸管的蠕動，不斷推擠腸內(nèi)容物向前，引起狹窄段近端腸管擴大，從而形成繼發(fā)性巨結(jié)腸，是嚴重影響兒童健康的先天性疾病。目前，HD保守治療效果差，多數(shù)需手術(shù)治療，但各種手術(shù)并不能從根本上恢復(fù)所有腸道功能，均有相應(yīng)缺陷和并發(fā)癥［1］，許多患兒術(shù)后腸道運動功能紊亂持續(xù)存在［2－3］，術(shù)后并發(fā)癥高達20% ～30%。

1 先天性巨結(jié)腸的發(fā)病機理及腸神經(jīng)嵴干細胞移植治療的理論基礎(chǔ)

腸道的運動由腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)控制，其解剖基礎(chǔ)是腸道壁內(nèi)具有神經(jīng)元的神經(jīng)叢。ENS的所有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均起源于神經(jīng)嵴干細胞，各種原因引起的神經(jīng)干細胞遷移和分化異常，均會造成腸神經(jīng)元解剖和功能異常，最終可導致HD。目前HD的病因尚未完全闡明，近年來在分子遺傳學領(lǐng)域取得了突破性進展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9個基因、4個區(qū)域與HD的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，編碼酪氨酸激酶通路的基因(包括RET原癌基因，GDNF基因，GFRa－I基因等)，編碼血管內(nèi)皮素信號通路的基因(包括EDNRB基因，EDN3基因和ECE－I基因)，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因(如 SOXl0基因和PHOX2B基因)，這些基因和區(qū)域的作用均圍繞RET信號通路和內(nèi)皮素信號通路展開，參與信號通路網(wǎng)絡(luò)組成或修飾核心基因，它們的異常將引起信號轉(zhuǎn)導的異常，影響神經(jīng)干細胞(neural crest stem cells，NCSC)的分化、增殖及移行。Iwashita等［4］發(fā)現(xiàn)4種高表達于NCSC的基因(RET、SOxl0、GFRal和EDNRB)發(fā)生缺失時，腸神經(jīng)嵴干細胞(gut neural crest stem cells，GNCSCs)明顯減少，并導致受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)發(fā)生了缺失，因此推測HD可能是一種神經(jīng)干細胞疾病。由此設(shè)想，能否通過移植GNCSCs至神經(jīng)元發(fā)育缺陷腸段，并使其在腸壁內(nèi)遷移、分化、增殖，恢復(fù)病變腸管神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而達到治療HD的目的。

2 GNCSCs的特點及影響其增殖、遷移的因素

腸神經(jīng)嵴干細胞(gut neural crest stem cells，GNCSCs)起源于胚胎期的神經(jīng)管背側(cè)，部分NCSCs定向分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，被稱為腸神經(jīng)嵴干細胞(GNCSCs)，其與CNS－NSCs比較，有相當不同的潛力，更可能對腸管特異性的環(huán)境起反應(yīng)，更接近于正常腸神經(jīng)系統(tǒng)生物學特性，而利用腸道神經(jīng)嵴干細胞未分化的特性來彌補腸道神經(jīng)節(jié)細胞的缺失，可能更適合于HD 的治療目的［5］，GNCSCs存在于腸道組織中，具有自我更新和分化能力，是未分化細胞分布于特定的已分化組織中，數(shù)量很少，在一定程度上維持細胞功能的穩(wěn)定狀態(tài)，腸神經(jīng)嵴細胞具有干細胞的特點，有自我更新的能力，能夠分化形成來自兩個胚層的多種細胞，GNCSCs主要來源于神經(jīng)嵴的2個部位，分別是迷走神經(jīng)嵴和骶神經(jīng)嵴，來源于迷走神經(jīng)嵴的GNCSCs首先進入前腸間質(zhì)，然后沿頭端向尾端方向遷移，最終定植于整個腸道［6］。

在GNCSCs的增殖、遷移過程中，GNCSCs自身的轉(zhuǎn)錄因子、受體與小生境所含的各種生長因子、細胞外基質(zhì)蛋白相互作用，從而保證細胞的存活、促進細胞增殖、誘導細胞遷徙至指定位置并定植、分化為特定的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，當膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)與受體RET結(jié)合即可激活GNCSCs存活的信號通路，而GDNF缺失就會誘導細胞凋亡［8］。GNCSCs總是朝著腸管中未結(jié)合狀態(tài)的GDNF方向移動，因此不同部位GDNF的濃度差是影響GNCSCs遷徙的重要因素。內(nèi)皮素3(EDN3)和其受體內(nèi)皮素受體B(EDNRB)也是GNCSCs發(fā)育中另一重要的配體受體信號通路，EDNRB及其配體EDN3基因突變會導致GNCSCs遷徙、定植失敗，證實該通路對GNCSCs具有促進增殖和抑制分化的作用［9］。SOX10表達于遷徙至胚腸間質(zhì)之前及其過程中的GNCSCs上，對GNCSCs的生存起著重要意義，Bondurand［10］發(fā)現(xiàn)，SOXl0可通過調(diào)節(jié)EDNRB的表達影響GNCSCs發(fā)育，維持GNCSCs的干細胞特性，抑制其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。神經(jīng)干細胞遷徙的啟動需要骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的參與，其遷徙受BMP－4及其拮抗蛋白 Noggin的影響［11］。BMPs對GNCSCs的促分化作用主要是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NT－3)的TrKC受體表達實現(xiàn)的，而NT－3可以直接或與GDNF、睫狀營養(yǎng)因子(ciliary neurotmphic factor，CNTF)聯(lián)合影響GNCSCs的分化和晚期腸神經(jīng)元的發(fā)育［12］，所以，GDNF、EDN3、SOX10、BMP 等是影響 GNCSCs增殖、遷移的主要因素。

3 腸神經(jīng)嵴干細胞移植治療先天性巨結(jié)腸的現(xiàn)狀

目前利用干細胞的多潛能性，恢復(fù)宿主的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能，目前應(yīng)用最多的是胎腦組織移植治療帕金森病，然而，在臨床上要獲得更多的腦組織有很大困難，除了來源困難外，還有倫理上的束縛。因此，如果能用外周組織中提取出來的神經(jīng)干細胞，在體外擴增后建立神經(jīng)干細胞株，再次移植至目標病變區(qū)域，將使干細胞移植變得簡單而有效。有研究表明可通過基因操作，篩選出單克隆神經(jīng)干細胞，如 Wangs［13］等將一種綠色熒光蛋白的基因轉(zhuǎn)導于細胞中，而該基因的啟動子為神經(jīng)元Ta蛋白，則該細胞可獲得綠色熒光蛋白的表達，通過熒光分析識別并分離出神經(jīng)干細胞，使目的干細胞得到純化。干細胞可以在分化前的培養(yǎng)過程中無限增殖，一些研究發(fā)現(xiàn)，把從胚胎神經(jīng)組織中分離獲得的神經(jīng)干細胞注入損傷模型動物大腦，神經(jīng)干細胞可遷移至損傷部位，并分化成所需要的細胞種類。Micci等［14－15］研究證明小鼠神經(jīng)干細胞移植到同類動物胃幽門部可以存活，并且可以檢測到神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，進一步研究發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)干細胞可以從功能上改善胃輕癱小鼠模型的胃排空能力。

腸神經(jīng)干細胞為更加特異分化的單能干細胞，有人亦稱之為腸神經(jīng)系統(tǒng)的祖細胞，理論上是治療腸神經(jīng)元發(fā)育缺陷癥或損傷性疾病更為適合的神經(jīng)干細胞。一直以來，干細胞移植治療HD的研究主要集中在胚胎干細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞，而GNCNCs相對上述干細胞而言，遷移能力更強，屬于腸神經(jīng)系統(tǒng)的定向前體細胞，易對腸道特異性小生境產(chǎn)生反應(yīng)，更能向所需要的腸道功能細胞發(fā)育。目前腦神經(jīng)干細胞的提取和培養(yǎng)已是一種成熟的研究方法，但腸神經(jīng)干細胞存在于腸管中，含量較少，有其他組織細胞混雜，提取困難，技術(shù)要求高，提取方法和條件獨特，不同于腦神經(jīng)干細胞，國內(nèi)外報道腸神經(jīng)嵴干細胞提取、培養(yǎng)的文獻亦較少［16－19］。Almond 等［20－21］報道，從人胚胎及嬰兒(生后5個月)腸管分離出GNCSCs，體外擴增培養(yǎng)后移植至無神經(jīng)節(jié)細胞的腸管中，該細胞可存活并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，移植后可獲得一部分腸管功能恢復(fù)［22］。王崗、肖莉等［23－24］已經(jīng)成功建立了分離培養(yǎng)純化及鑒定腸神經(jīng)嵴干細胞的方法，并將其成功地移植入動物模型。近期，Metzger等［25］從80歲老人腸管分離和體外培養(yǎng)了腸祖細胞，并分化為具有ENS特征的神經(jīng)元及其亞型和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，成體腸管分離、體外培養(yǎng)腸祖細胞的成功使我們更加確信GNCSCs存在于生后腸管且在一定條件下能進一步分化為ENS神經(jīng)元及其亞型，為干細胞移植治療HD帶來希望。張建軍等［26］實驗證實在HD患兒腸黏膜層存在ENS干細胞，可以從HD患兒有神經(jīng)節(jié)段腸管的腸黏膜活檢標本中分離、體外培養(yǎng)ENS于細胞，這不僅增加了干細胞移植的來源，還可以對HD患兒行自體干細胞移植，同時解決了干細胞移植的倫理學問題、移植后的免疫排斥反應(yīng)等。上述實驗表明，將GNCSCs在體外大量擴增后移植至神經(jīng)節(jié)細胞缺失腸段，使其遷移至病變腸段并分化成所需要的細胞種類，以達到治療先天性巨結(jié)腸的目的，具有現(xiàn)實意義及可行性。

4 展望

腸神經(jīng)嵴干細胞移植治療先天性巨結(jié)腸雖還處于一些實驗研究和移植嘗試階段，但已有研究證實其移植的可行性。然而，在進行臨床應(yīng)用前，尚有許多問題需要解決，目前仍需應(yīng)用生物化學和基因技術(shù)來了解GNCSCs是如何發(fā)揮作用的，怎樣使正常的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功能，GNCSCs移植后新生神經(jīng)元與周圍組織的整合、神經(jīng)元軸突定向生長、與靶細胞之間的突觸形成等問題，還需了解移植后干細胞存活時間及移植后排斥問題等。而成體腸管組織中腸神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量極少，且腸道中細菌多，原代培養(yǎng)時單細胞懸液的制作過程中，如何解決污染的問題并有效提取出腸神經(jīng)嵴干細胞，也是需解決的難題。在醫(yī)療安全日益受到關(guān)注的今天，有必要探索新的安全手段，進行GNCSCs介導的基因治療，GNCSCs移植研究使人們看到了從根本上治愈先天性巨結(jié)腸的希望，相信在不久的將來，這一領(lǐng)域的研究將會有新的突破。

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