李書俊(綜述)，王達(dá)利(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，貴州遵義 563099)

干細(xì)胞(stem cell)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，可分化為多種功能性成體細(xì)胞。其增殖及分化受多種信號通路的調(diào)控，如:Wnt/βcatenin、Sonic hedgehog、Notch等;其中 Notch介導(dǎo)的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在該過程中發(fā)揮重要作用［1－2］。Notch基因最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，得名于其功能部分丟失能夠?qū)е鹿壋峋壋霈F(xiàn)一缺口(Notch)［3］，是一組在進(jìn)化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)［4］。Notch基因在果蠅等無脊柱動物以及人體內(nèi)廣泛表達(dá)，在果蠅體內(nèi)僅有一個 Notch基因，而人類Notch家族有四個成員(Notch1－4)［3］。Notch蛋白為一種跨膜受體，其激活后通過鄰近細(xì)胞間相互信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用來調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化［5－6］。現(xiàn)主要圍繞Notch信號通路組成及其在成體干細(xì)胞增殖和分化中的作用作一綜述。

1 Notch信號通路的主要組成

Notch信號通路由受體、配體、CSL(CBF1/RBP－Jκ/Suppressor of Hairless/LAG －1，CSL)及其下游靶基因組成［3］。果蠅中存在一個Notch受體和兩個配體(Delta和Serrate)。哺乳動物中有4個Notch同源受體(Notch－1、Notch－2、Notch－3和Notch－4)，分別定為于染色體9 q34、Ip13–p11、19 p13.2 – p13.1 和 6 p21.3;Notch 同源受體均為I型跨膜蛋白，主要由細(xì)胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞外區(qū)三部分結(jié)合構(gòu)成，胞內(nèi)區(qū)包含一個N端RAM結(jié)構(gòu)域、6個錨蛋白樣重復(fù)序列、2個核定位信號、1個轉(zhuǎn)錄激活區(qū)及1個PEST結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)將Notch信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。胞外區(qū)有29～36個生長因子(epidermal growth factor－like repeats，EGF－R)和3個 LNR(Lin/Notch repeats)重復(fù)序列，其中第11、12個EGF－R重復(fù)序列介導(dǎo)與配體的相互作用。哺乳動物有6個Notch同源配體，其中與Delta同源的稱為Delta配體，分別為Delta－1、Delta－3、Delta－4、Delta－Like;與 Serrate同源的稱之 Jagged－1 和 Jagged－2［7－8］。Notch 配體在果蠅中為 Delta和 Serrate，在線蟲中為Lag－2。因此，Notch配體又稱為DSL(Delta－Serrate－Lag－2)膜蛋白。DSL是Ⅰ型跨膜蛋白，同樣具有數(shù)量不同的EGF－R重復(fù)序列，保守的N端為Notch受體結(jié)合和活化所必需的DSL基序［8－9］。CSL是Notch信號通路的重要成員，為CBF1、Su(H)、Lag－1首寫字母的縮寫，是該蛋白在哺乳動物、果蠅、線蟲的不同名稱。未活化的CSL通過招募Smar、Skip、1、2型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种茝?fù)合物，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子。Notch信號通路的靶基因主要為堿性螺旋－環(huán)－螺旋(basic－h(huán)elix－loop－h(huán)elix，bHLH)基因［10］。包括HES(members of the hairy and enhancer of split，HES1，2)和 HRT 家族(hairy related transcription factor families of basic－h(huán)elix－loop－h(huán)elix transcriptional repressors，Hrt－1，2，3)。如哺乳動物中的Hes基因(hairy enhancer of split)、果蠅中與毛基因同源的 hairy及［E(sp)l］(enhancer of split)及非洲爪蟾中的 Xhey1 等［11］。

2 Notch通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

Notch信號通路有兩種:CSL依賴通路和CSL非依賴通路。目前的研究主要集中在經(jīng)典CSL依賴通路，Notch受體被臨近細(xì)胞表面的配體(Delta和Jagged)激活，經(jīng)TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE酶)催化，胞外亞基(Notch extracellular domain，NEC)被切割(S1位點(diǎn))后釋放;經(jīng)γ分泌酶(γ－secretase)催化的跨膜內(nèi)部切割(S3位點(diǎn))并釋放胞內(nèi)亞基(Notch intracellular domain，NICD)，繼而轉(zhuǎn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子CSL(在哺乳動物中稱為CBF1)的β折疊結(jié)構(gòu)域(RHR －n)結(jié)合形成NICD－CSL復(fù)合體。該復(fù)合體的Rel同源區(qū) (RHR)及其 N端31－435位氨基酸殘基與特定的DNA(GTGGGAA)序列結(jié)合，進(jìn)而激活 HES、HRT等靶基因［4］。Notch信號通路不需要第二信使和蛋白激酶的參與，它直接通過接收鄰近細(xì)胞的信號后傳到細(xì)胞核，活化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)雖然不能放大信號，但使調(diào)控細(xì)胞分化這種決定細(xì)胞命運(yùn)的重要功能更加精確［12］。Arias等［13］在研究 Notch 基因突變的果蠅發(fā)現(xiàn)了CSL非依賴途徑，后來在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Deltex蛋白為Notch信號通路下游靶點(diǎn)反饋調(diào)節(jié)Notch信號通路。對于其他CSL非依賴途徑的信號通路尚缺乏證據(jù)［14］。

3 Notch信號通路對胚胎干細(xì)胞增殖和分化的影響

胚胎干細(xì)胞(ESC)屬于全能性干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化能力，可以分化為各種類型的細(xì)胞，發(fā)育成為各種組織器官。Thomas等［15］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Notch通路能夠抑制ESCs向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化。Xiao等［16］通過觀察小鼠用維甲酸(RA)誘導(dǎo)ESC分化為神經(jīng)細(xì)胞的過程，發(fā)現(xiàn)小鼠ESC的Notch l蛋白的表達(dá)較高，但隨著RA對ESC的誘導(dǎo)分化，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，Notch l蛋白的表達(dá)逐漸減少。結(jié)果表明，Notch 1在維持ESC的分化潛能中發(fā)揮作用。Taeko等［17］采用轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)ESCs對誘導(dǎo)分化表現(xiàn)出不同反應(yīng)，Notch－Hes1在小鼠ESCs中的表達(dá)較波動，Hes1含量較高的ESCs對向中胚層細(xì)胞分化敏感，而Hes1含量低的ESCs對向神經(jīng)元分化較敏感。Hes1含量不同ESCs所產(chǎn)生的結(jié)果與Notch信號通路的失活和激活密切相關(guān)。

4 Notch通路調(diào)控成體干細(xì)胞的增殖、分化

目前已從皮膚、肺臟、肌肉、骨髓、脂肪、小腸、腦分離出具有多向分化能力的成體干細(xì)胞［18－20］。根據(jù)干細(xì)胞的分化潛能可分為:全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞。一般認(rèn)為只有胚胎干細(xì)胞(v)是全能干細(xì)胞，具有發(fā)育為成熟個體的潛能。成體干細(xì)胞的多能性已部分喪失，其發(fā)育潛能受組織特異性限制，不能跨系分化。但目前成體干細(xì)胞誘導(dǎo)跨系分化的研究結(jié)果并不少見，這一看似矛盾的現(xiàn)象可能是由于對成體干細(xì)胞的認(rèn)識不夠成熟，也可能是體外培養(yǎng)成體干細(xì)胞不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境所致［2］。Notch信號通過控制細(xì)胞命運(yùn)決定在增殖、分化調(diào)控中起著重要作用［21－22］。本文主要討論Notch信號通路對造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響。

4.1 對造血干細(xì)胞增殖和分化的影響 研究表明，Notch信號通路在造血系統(tǒng)中發(fā)揮多種重要功能。普遍認(rèn)為Notch對造血干細(xì)胞分化命運(yùn)起決定作用;通過維持造血干細(xì)胞的增殖及分化潛能，發(fā)揮維持干細(xì)胞池的作用，但對成熟后的各種血細(xì)胞沒有明顯維持作用。Notch還是胸腺中的T細(xì)胞早期發(fā)育的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［23－24］。Suzuki［16］等向體外培養(yǎng)的臍血造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入可溶性的 Dela－1，輔以干細(xì)胞因子(stem cell factor)、血小板生成素等共培養(yǎng)，使造血干細(xì)胞存活率增加，并使再增殖細(xì)胞(SRCs)數(shù)量擴(kuò)增六倍［25］。Notch信號對增殖和分化的調(diào)節(jié)又是非常復(fù)雜的。Neves等［26］將表達(dá) CD34+、CD38+的造血干細(xì)胞與表達(dá)Delta－1、Jagged－1的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果提示:Delta－1可增加單向分化祖細(xì)胞(CFU－G/CFU－M)的數(shù)量，但不影響終末細(xì)胞數(shù)量;Jagged－1則使CFU－GM和已分化的單核細(xì)胞數(shù)量減少。當(dāng)CD34+臍血造血細(xì)胞與高表達(dá)Delta－4的基質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)時，加入促紅細(xì)胞生成素，可促進(jìn)CD34+臍血細(xì)胞向紅系的發(fā)育。反之，如阻斷Delta－4的表達(dá)，這一分化作用即被抑制。由此認(rèn)為Delta－4有促進(jìn)人造血干細(xì)胞分化的作用［27］。

4.2 對間質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響 來源于中胚層的間質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于各類軟組織當(dāng)中，如脂肪、骨髓、真皮、肝、肺、羊膜等。Huang 等［28］報(bào)道，抑制Notch通路的激活，可促進(jìn)小鼠脂肪干細(xì)胞(mASCs)的早期成脂分化，其機(jī)制可能與抑制Notch2－Hes1通路，進(jìn)而提高小鼠脂肪特異轉(zhuǎn)錄因子(PPRAR－γ)蛋白的表達(dá)，降低DLK－l/Pref－l基因的表達(dá)有關(guān)。Zuk等［29］采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓來源干細(xì)胞(ADSCs)，誘導(dǎo)ADSC向成脂細(xì)胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)錄抑制劑降低Notch2的表達(dá)，可促進(jìn)ADSCs分化為成脂細(xì)胞。Osathanon等［20］采用克隆環(huán)技術(shù)分離出了人類脂肪組織衍生的單克隆細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀及免疫熒光鑒定其脂肪來源間質(zhì)干細(xì)胞的特征。同時研究Notch信號在這些脂肪來源的單克隆細(xì)胞分化中的作用。發(fā)現(xiàn)這些單克隆細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。然而，每種單克隆細(xì)胞的分化潛能是不同的。與高脂肪源性細(xì)胞相比，低脂肪源性細(xì)胞中 Notch2、3、4，Jagged 1 和Delta 1 mRNA 表達(dá)較高。但高成骨細(xì)胞和低成骨細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)Notch信號的mRNA表達(dá)改變，而低和高脂肪源性單克隆中Notch受體mRNA表達(dá)均減少。此外，采用Notch通路阻斷劑(DAPT)可提高脂肪分化。表明Notch信號能抑制單克隆ADSC的成脂分化，并對間質(zhì)細(xì)胞分化命運(yùn)有重要影響。

Ling等［30］發(fā)現(xiàn)小鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為神經(jīng)元過程中，MicroRNA－9、神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物(GFAP)，微管相關(guān)蛋白2(MAP－2)表達(dá)增加，Notch 1表達(dá)明顯減少。說明MicroRNA－9通過下調(diào)Notch信號通路促進(jìn)小鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元。Tao Wang等［31］發(fā)現(xiàn)在胚胎14 d的肝組織和胎肝干/祖細(xì)胞(FLSPCs)內(nèi)Notch3高度表達(dá)，而在FLSPCs向成熟肝細(xì)胞分化的過程中，Notch3及其他干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)均逐漸降低。當(dāng)加入Notch通路阻斷劑DAPT后，F(xiàn)LSPCs分化為肝細(xì)胞/肝樣比率明顯升高，提示阻斷Notch信號通路可促進(jìn)FLSPCs向肝細(xì)胞分化。進(jìn)一步提示Notch3不僅是FLSPCs分化為肝細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，也是FLSPCs的標(biāo)志物。牛萍等［32］發(fā)現(xiàn)離體實(shí)驗(yàn)中犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，離體培養(yǎng)可形成鈣結(jié)節(jié)并且為軟骨細(xì)胞，并具有心肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，同時在增殖初期可見Notch蛋白的表達(dá)，當(dāng)分化為骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞時，Notch1蛋白的表達(dá)下降。

4.3 對神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響 Notch信號通路在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化過程中也具有重要的作用，是維持干細(xì)胞特征及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的重要條件［33］。張琦等［34］將神經(jīng)干細(xì)胞離體培養(yǎng)，并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn):在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中見PS1 mRNA表達(dá)均明顯下降，PS1的蛋白表達(dá)也顯著降低，但Notch1、HES1mRNA表達(dá)僅在神經(jīng)干細(xì)胞分化初期下降，分化后期各階段則無明顯差異。該結(jié)果提示Notch信號通路在維持體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖中起著重要的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的活化可促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞分化，故Notch的促細(xì)胞增殖作用可能同時在神經(jīng)干細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖中體現(xiàn)［35］。

5 展望

在調(diào)控干細(xì)胞增殖、分化中，除 Notch信號通路外，同時還存在其他信號通路，根據(jù)它們所在的微環(huán)境中，通過細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在維持干細(xì)胞特性或促進(jìn)干細(xì)胞多向分化中發(fā)揮決定性作用，從而促進(jìn)或抑制干細(xì)胞自我更新，影響和決定各種組織器官或惡性腫瘤的生理和機(jī)理狀況［36－37］。此外，不同生長因子與 Notch通路共同作用，參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化［38］。因此，深入研究Notch信號通路有關(guān)的調(diào)控基因及其效應(yīng)將更加有助于理解干細(xì)胞的增殖、分化及其調(diào)控機(jī)制。

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