閻 偉，白增亮，侯玉芬

1.山東大學(xué)生命科學(xué)院發(fā)育免疫學(xué)（濟(jì)南 250011）

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（濟(jì)南 250011）

靜脈血栓形成（DVT）與炎癥有密切關(guān)系，它們互相聯(lián)系，炎癥能引起血栓，血栓可加重炎癥。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞激活是這一反應(yīng)的關(guān)鍵，活化的內(nèi)皮細(xì)胞在NF-κB 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，產(chǎn)生一系列黏附分子、細(xì)胞因子、酶類等介質(zhì)，介導(dǎo)或直接參與白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用以及血管的損傷。本研究以TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從?xì)胞分子角度、蛋白基因水平來探討NF-κB的表達(dá)及中藥消栓通脈顆粒的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar 雄性大鼠30 只，12 周齡，體質(zhì)量200～250 g，SPF級，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（許可證號：SCXK魯2003004）。大鼠自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度23～25 ℃，相對濕度7%左右，定期紫外線室內(nèi)消毒，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為消栓通脈顆粒劑分高、中、低劑量三組。

1.2 主要試劑 重組人TNF-α（sigma 公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304（武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心）；NF-κ B p65 siRNA（Cell signaling）；LipofectamineTM2000 復(fù)合物（全式金公司）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）；消栓通脈顆粒，由茵陳、雙花、赤小豆、桃仁、黃柏、紅花、赤芍、山梔、水蛭、蒼術(shù)組成，每克相當(dāng)于3.2 g生藥(由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，魯藥制字Z0120030051)，用蒸餾水制成懸濁液，每mL含1 g消栓通脈顆粒劑。按照人與動物公斤體重比值進(jìn)行藥物劑量的折算。消栓通脈顆粒低劑量為0.6 g/100 g 大鼠，消栓通脈顆粒中劑量為0.9 g/100 g 大鼠，消栓通脈高劑量為1.2 g/100 g，采用灌胃給藥，消栓通脈顆粒劑分高、中、低劑量分別灌胃隨機(jī)分組的大鼠，上下午各一次，間隔12 h，連續(xù)3 d，第4 d灌胃后，大鼠股動脈無菌采血，立即置于不加抗凝劑的試管內(nèi)，離心后分離血清，滅活補(bǔ)體后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型制備 TNF-α激活人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，購買人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系，復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)，按1∶2 比例接種傳代或調(diào)整細(xì)胞密度到1×106個/mL 分96 孔或24 孔板。用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋腫瘤壞死因子α（TNF-α）至10 μg/L，孵育細(xì)胞。6 h后更換培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組分別每孔加入100 μL帶有高、中、低不同劑量含藥血清的培養(yǎng)基，對照組每孔只加入100 μL 培養(yǎng)基，不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 之后，收集細(xì)胞用于分析。

1.4 檢測指標(biāo) RT-PCR 檢測目的基因NF-κB 表達(dá)量變化：選用Oliger(dT)引物，按Promega 公司Reverse Transcription System 說明書進(jìn)行，根據(jù)內(nèi)參調(diào)整PCR模板量，在一致條件下比較NF-κB表達(dá)的變化。PCR引物如下：

GAPDH：

Forward:5’-TGCGACTTCAACAGCAACTGA-3’

Reverse:5’-GTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’

NF-κB：

Forward：5’-CCCACAGAGCTTGTAGGAAAG-3’

Reverse：5’-TAGTCCCCACGCTGCTCTTCT-3’

Western-blotting 方法檢測目的蛋白NF-κB 表達(dá)量的變化，α-Tublin 內(nèi)參對照，一抗NF-κB p65和單抗免IgG-HRP 二抗為美國santa cruz 公司產(chǎn)品。二抗goat anti-rabbit IgG-HRP（santa cruz biotechnology, 美國）。

1.5 結(jié)果分析 Quantity One 軟件分析RT-PCR 和蛋白免疫印記結(jié)果，NF-κBmRNA 及蛋白表達(dá)量以NF-κB 與內(nèi)參條帶光密度值的比值表示。采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，多組間差異比較用方差分析，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)（圖1） RT-PCR 結(jié)果顯示，TNF-α 激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)與對照組相比有顯著性差異（P ＜0.01），人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，NF-κB mRNA的表達(dá)水平比未激活的細(xì)胞中明顯升高。

圖1 TNF-α激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)

2.2 消栓通脈顆粒劑使激活后的人臍靜脈細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平減低（圖2、圖3） RT-PCR和蛋白免疫印記結(jié)果顯示，經(jīng)消栓通脈顆粒劑干預(yù)后，激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的NF-κB表達(dá)水平下降，且該抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)，高劑量含藥血清作用下，NF-κB 表達(dá)水平與對照組相比顯著降低（P ＜0.01）。

圖2 不同消栓通脈顆粒劑量刺激下NF-κB mRNA表達(dá)

圖3 不同消栓通脈顆粒劑量刺激下NF-κB 蛋白表達(dá)

3 討論

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是一種常見的四肢血管血栓栓塞性疾病，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲骨科大手術(shù)后發(fā)生率為31%，我國人工關(guān)節(jié)成形術(shù)后發(fā)生率為47.1%[1]。 急性期易并發(fā)肺栓塞(pulmonary embolism，PE)，死亡率較高。慢性期因靜脈瓣膜遭受破壞，至晚期患肢出現(xiàn)腫脹、郁積性皮炎、頑固性潰瘍等后遺癥，嚴(yán)重影響病人的生命質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)炎癥與血栓形成之間存在著顯著而錯綜復(fù)雜的聯(lián)系，在DVT 病理過程中，NF-κB 被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。NF-κB 是血管炎性過程中的中心轉(zhuǎn)錄控制點(diǎn)，以NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族為調(diào)控中心的內(nèi)皮細(xì)胞活化及炎癥基因誘導(dǎo)途徑有可能成為有關(guān)危險因子促血栓形成的共同途徑[2-3]。TNF-α是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌的炎癥介質(zhì)[4]。對血管內(nèi)皮細(xì)胞有多方面的作用，其損傷作用表現(xiàn)為對血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用或通過其他細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損害[5]。

消栓通脈顆粒由茵陳、金銀花、赤小豆、桃仁、黃柏、紅花、赤芍藥、梔子、水蛭、蒼術(shù)組成，諸藥合用，共奏清熱利濕，祛瘀通絡(luò)，消腫止痛之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)：茵陳還有抗凝血及促纖溶的功效。赤芍藥具有抗血小板聚集、改善血液流變學(xué)、抑制凝血酶原等多種作用。桃仁有抗急性炎癥滲出的作用，對體外血栓形成具有明顯的抑制作用。水蛭富含蛋白質(zhì)、水蛭素、肝素等物質(zhì)，具有抗凝、抗血栓等作用。實(shí)驗(yàn)表明，金銀花對早期血管通透性增高和滲出性水腫具有明顯抑制作用，而黃柏中的小檗堿成分具有抗血小板聚集的作用。紅花黃色素作為紅花的主要作用成分具有抑制血小板聚集和釋放，抗凝血，抑制血栓形成，抗氧化、抗氧自由基等作用。

通過研究以TNF-α 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，用含中藥消栓通脈顆粒血清進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)證明：TNF-α 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可使NF-κB表達(dá)顯著增加，消栓通脈顆粒含藥血清可以抑制NF-κB 的表達(dá)。NF-κB 是調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，而這些因子又對相應(yīng)細(xì)胞的活化、增殖、浸潤、趨化和分泌功能起著直接的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和炎癥的中心環(huán)節(jié)，也是諸多炎性介質(zhì)產(chǎn)生的共同通路。NF-κB不僅參與了炎癥發(fā)生的過程，而且在血栓形成中可能還扮演著十分重要的角色。NF-κB作為炎癥與血栓過程中多種細(xì)胞活性分子的匯聚點(diǎn)，有可能成為防治DVT的新的理想靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：消栓通脈顆粒明顯抑制TNF-α激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)，阻止炎癥—血栓反應(yīng)，從而防治血栓形成。

[1]呂厚山.人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢深靜脈血栓形成和肺栓塞的防治[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志,2007,3(3):201-204.

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[5]高笑舸，崔桅.中藥對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究概況[J]. 天津藥學(xué)，2003，15（2）：42-45.