尹春香，王曉非

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院風濕免疫科，沈陽 110004）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蝕性滑膜炎為特點的自身免性疾病，其主要臨床特征是對稱性關節(jié)炎和功能下降。干擾素調節(jié)因子家族是能對干擾素的基因表達進行調控的一類轉錄因子，通過調控淋巴細胞分化、平衡過程，參與炎性反應、細胞周期和細胞凋亡等生物學過程，在自身免疫性疾病發(fā)病中起一定作用。目前已知干擾素調節(jié)因子4（interferon regulation factor，IRF4）作為干擾素調節(jié)因子的一種，通過影響淋巴細胞的分化及干擾素轉錄調控等參與炎癥過程［1］，在自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡［2］等發(fā)病中起重要作用。本文對RA患者外周血IRF4的表達進行研究，分析其與相關臨床活動性指標的關系，初步探討IRF4在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

30例患者來自中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院風濕免疫科2012年12月住院患者，其中女25例，男5例，年齡26～48歲，平均（36±12）歲，所有患者均符合1997年美國風濕病學會（ARA）制定的RA分類標準，排除有嚴重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫病。正常對照組28名，其中女22名，男6名，年齡21～54歲，平均（35±6）歲，均為我院體檢的正常人群，均身體健康，無肝、肺、腎臟疾患病史，無心血管系統(tǒng)病史，查體及血生化檢查均無異常。研究組與對照組在性別、年齡構成上差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑：Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）、SYBR green PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）、聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀ABI9700型（美國ABI公司）。

1.2.2 實驗步驟

1.2.2.1 Trizol法抽提總RNA 安靜狀態(tài)下抽取靜脈全血1 mL，檸檬酸鈉（ACD）抗凝，用淋巴細胞分離液分離獲得白細胞，按每毫升全血加入1 mL Trizol的比例加人Trizol試劑，使沉淀的白細胞溶解，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇抽提，以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解總RNA，-80℃冰箱低溫保存。

1.2.2.2 使用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒 總體積 20 μL，ddH2O：12 μL，mRNA：4 μL，PrimeScript RT Master Mix：4 μL，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃5 s。

1.2.2.3 引物設計 檢索NCBI數據庫查到人類IRF4基因的cDNA全長序列，以甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參照基因，設計擴增板的引物，各引物均由TaKaRa公司合成，IRF4正向引物：5′?GCCCAGCTTGTGAAAATG ?3′，反向引物：5′?CGGC AGTCTGAGAACGC ?3′；GAPDH正向引物：5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC ?3′； 反向引物：5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′。

1.2.2.4 熒光定量PCR反應 總體積為20 μL：SYBR混合物10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s（共40個循環(huán)）。

以SDS2.1軟件分析其CT值。CT值反映了模板擴增到一定量拷貝數時（處于指數上升期）所需反應循環(huán)數的大小。CT值越大，參與反應的起始模板量就越少，反之則越多。計算出標化后的-△△CT值。

1.2.3 RF、CCP、CRP、血沉的檢測：由我院檢驗科協(xié)助完成，異常指標的判斷均參考同期該項檢查的正常值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17統(tǒng)計分析軟件包統(tǒng)計分析，計量資料均采用±s。各組-△△CT值采用t檢驗，IRF4 mRNA水平與其他血清學指標之間相關性檢驗采用Pearson相關分析，以P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

IRF4 mRNA定量表達：RA患者IRF4 mRNA的表達（-6.94±0.10）明顯高于正常對照組（-7.62±0.13），差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.01）。

IRF4 mRNA水平與RA患者紅細胞沉降率、CRP、RF、CCP進行相關性分析RA患者IRF4 mRNA水平與類風濕因子（RF）呈正相關（r=0.726，P＆lt;0.05）、與抗環(huán)瓜氨酸多肽（抗CCP）抗體呈正相關（r=0629，P＆lt;0.05），與血沉、CRP不相關（P＆gt;0.05）。

3 討論

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性滑膜炎為特點的自身免疫性疾病。RA患者由于滑膜的炎癥以及過度的增生致軟骨和骨的進行性破壞，最終導致嚴重的殘疾并導致患者生活質量下降。盡管RA的發(fā)病機制目前還不明確，但隨著分子生物學和免疫學的進展，RA動物模型的建立，人們發(fā)現RA發(fā)病機制與Th細胞的亞型及相關細胞因子平衡密切相關，Th17/調節(jié)性T細胞及相關細胞因子平衡可能與RA發(fā)病機制相關。大量的研究認為Thl7細胞能產生IL?17、IL?21等細胞因子，功能在于通過這些細胞因子集體動員、募集及活化中性粒細胞，從而介導中性粒細胞向炎癥部位遷移，誘導炎性反應。

IL?17是Thl7細胞產生的最重要效應因子，其受體在體內廣泛表達，具有強烈的促炎癥作用。Thl7細胞的生物學活性主要通過IL?17來實現。IL?17通過誘導炎性趨化因子的產生刺激炎性細胞的聚集，通過促進促炎性細胞因子（TNF?α，IL?6和 IL?1）的產生增強炎性反應，通過上調RANK配體的表達、誘導一氧化氮的產生和基質金屬蛋白酶的表達介導軟骨的破壞和骨侵蝕［3，4］，在患有RA的鼠和人群中，IL?17的產生增加，且其升高水平與關節(jié)破壞的嚴重程度相關，缺乏IL?17的鼠不會發(fā)生膠原誘發(fā)性關節(jié)炎（CIA）［5，6］。IL?21對于類風濕關節(jié)炎的病理生理有多種作用，是B細胞應答和免疫球蛋白G（IgG）產生的主要調節(jié)因子［7，8］，在RA患者異常的免疫應答中起重要作用，RF和抗CCP抗體之類的自身抗體的表達最具特征性［9］，阻斷IL?21/IL?21受體途徑能有效改善CIA的病變，去除IL?21的鼠其關節(jié)炎的進展被完全阻止。

最近的研究表明干擾素調節(jié)因子4（interferonregulatory factor 4，IRF4）可調控Thl7分化的基礎性作用。無論是在經典的（TNF?β與IL?6）還是替代的（TNF?β與IL?21）Thl7細胞誘導條件下培養(yǎng)，IRF4缺陷小鼠的CD4+T細胞均不能完全分化成Thl7細胞并產生IL?17。這一缺乏對CD4+T細胞來說是內在的，而不是繼發(fā)于任何發(fā)展變化中。IRF4作為Thl7分化的一個重要控制因子，在體內具有重要作用。IRF4不僅是IL?17的早期產生必不可少的，而且也是Thl7細胞自分泌IL?21絕對需要的。事實上，無論是根據經典的或替代的Thl7細胞誘導培養(yǎng)條件，IRF4缺乏的CD4T細胞不能產生IL?2l，從而對Th17細胞的形成缺少一步關鍵的放大作用。

本文采用熒光定量PCR方法檢測RA患者外周血IRF4 mRNA表達情況，結果發(fā)現RA患者外周血IRF4 mRNA表達水平比對照組高（P＆lt;0.01），證明其與類風濕關節(jié)炎關系密切，其可能通過調節(jié)IL?17和IL?21的產生導致類風濕關節(jié)炎的發(fā)生。

近年研究證明，抗CCP抗體可用于RA的早期診斷，除了診斷性檢驗外，還可能是可用的預測指標，對RA患者長期隨訪發(fā)現，出現抗CCP抗體為發(fā)生侵蝕性關節(jié)炎的一個危險因素?？笴CP抗體陽性的RA患者更易于發(fā)展為持續(xù)性骨侵蝕性關節(jié)炎。RF陽性RA患者較RF陰性RA患者有較差的預后，在關節(jié)畸形、放射學侵蝕、關節(jié)外表現方面RF陽性RA患者中更多見、更嚴重。本研究顯示IRF4 mRNA表達水平與類風濕因子、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體水平呈明顯正相關，提示IRF4 mRNA表達水平可能與類風濕關節(jié)炎骨侵蝕程度相關。

綜上所述，高表達的IRF4在RA的發(fā)病中起一定作用，且與疾病活動指標具有相關性，但它們之間的相互作用的關系仍不明確。應進一步加大研究IRF4與RA的相關性，以明確IRF4的作用，期待為RA的預防、診斷和治療提供幫助。

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