黨 巖,張 瑞,葉杰旭,艾 晗,孫德智*

(1.北京林業(yè)大學水體污染源控制技術(shù)北京市重點實驗室,北京100083；2.浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院,浙江 杭州 310032)

垃圾焚燒作為城市生活垃圾減量化、無害化、資源化的一個有效手段,近年來得到越來越廣泛的應用.由于我國城市生活垃圾廚余物多,含水率高,在焚燒過程中會產(chǎn)生大量的滲瀝液[1],需要收集后集中處理.垃圾焚燒滲瀝液成分復雜,C O D相比于垃圾填埋場滲濾液更高(＞70000mg/L)[2],同時還含有高鹽度、高氨氮、多種難降解物質(zhì)(如腐殖酸等),處理難度大[1,3].厭氧生物處理具有處理效率高、能耗低、運行成本低等優(yōu)點,國內(nèi)外普遍采用膨脹顆粒污泥床(EGSB)等厭氧生物處理工藝處理垃圾填埋場滲濾液[4-6].但是,對于垃圾焚燒滲瀝液的處理并不多見.垃圾滲瀝液微生物種群在很大程度上決定了反應器的運行狀況.通過研究垃圾焚燒滲瀝液處理工藝超負荷運行前后的微生物群落結(jié)構(gòu)變化能夠全面掌握工藝處理效率降低的機理,指導工藝的穩(wěn)定運行.

本實驗采用實驗室小試EGSB反應器處理垃圾焚燒廠滲瀝液,考察了反應器有機負荷對COD去除率以及出水揮發(fā)酸(VFAs)含量的影響,最終超負荷狀態(tài)下運行11d,并對超負荷運行前后的厭氧顆粒污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)進行了研究.

1 材料與方法

1.1 EGSB反應器的運行

實驗室小試EGSB反應器由有機玻璃加工而成,有效容積4L(圖1).內(nèi)徑60mm,主反應區(qū)高徑比為12：1.內(nèi)回流系統(tǒng)使主反應區(qū)內(nèi)的液體上升流速保持在1.8m/h,反應器運行溫度維持在(33±1)°C.接種污泥取自河南某實際處理啤酒廢水的UASB反應器,MLVSS/MLSS為0.72.接種污泥量為6.4g MLVSS/L.

圖1 EGSB反應器裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the lab-scale EGSB reactor

1.2 試驗用水與工藝運行條件

試驗用水采用北京市某垃圾焚燒發(fā)電廠滲瀝液,其主要水質(zhì)特點如表1所示.實驗進水采用垃圾滲瀝液與自來水根據(jù)需要按一定比例混合,并儲存于4℃冰箱中.進水COD從5000mg/L開始逐漸提高,在反應器運行第1～56d水力停留時間 (HRT)保持在2.5d,第57～67d,以垃圾滲瀝液原水為進水,為調(diào)整反應器有機負荷,HRT延長至3d.

表1 垃圾焚燒滲瀝液主要水質(zhì)特點Table 1 Characteristics of leachate from MSW incineration plant

1.3 分析項目及方法

COD的測定采用重鉻酸鉀滴定法,pH值的測定采用Thermo Orion 3-Star pH測定儀.水樣中的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等的測定采用氣相色譜法(氣相色譜儀,Agilent 7890)配置Agilent HP-INNOWAX毛細管柱(30m,0.53mm,1.0μm)和氫火焰檢測器(FID),測定條件參考Bertin等[7]的方法.

1.4 厭氧顆粒污泥樣品與總DNA的提取

在EGSB反應器運行至第56,67d時,從反應器主反應區(qū)中下部取出少量顆粒污泥,用于DNA的提取.總DNA的提取,采用滾珠震蕩機械破碎法[8]對顆粒污泥進行破碎,根據(jù)Omega公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒說明書對總DNA進行提取.提取純化后的DNA經(jīng)微量紫外分光光度計進行測定,2個樣品A260/A280值分別為1.798和1.773,說明提取的DNA純度較好.

1.5 PCR的擴增及克隆文庫的構(gòu)建

以總DNA為模板,分別以細菌和古菌的通用引物 27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 和109F/915R(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′/5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTT-3′)對其細菌和古菌進行16S rRNA基因擴增,用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,將目的條帶切膠回收并純化.

將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體(Promega)上,然后轉(zhuǎn)化到高效率感受態(tài)細胞JM109中.在 LB/氨芐/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)18h.經(jīng)藍白斑篩選陽性克隆子,并通過引物T7/SP6進行菌落PCR擴增鑒定.

利用限制性內(nèi)切酶對陽性克隆轉(zhuǎn)化子進行酶切分類.對于細菌的16S rRNA基因擴增片段采用Rsa I和Msp I,對于古菌的16S rRNA基因擴增片段采用Rsa I和Taq I[9].在3%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,以了解每個克隆子中所含微生物片段的類型,并整合分類.

對插入質(zhì)粒載體的目的DNA片段測序(中美泰和生物技術(shù)公司),將所得序列中相似度大于97%的序列歸類為一個操縱子(OTUs),不同的OTU用BLAST程序在NCBI的Genbank上搜索相似序列,確定樣品中所含微生物所屬的種類范疇,通過MEGA(version 5)軟件繪制neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹.用Bootstrap評估樹的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 EGSB反應器的運行

由圖2可見,反應器運行第1～56d,進水COD從大約5000mg/L逐漸提高到約55000mg/L,HRT保持在2.5d,有機負荷從2.1kgCOD/(m3·d)逐漸提升到23.1kgCOD/(m3·d).COD去除率在第7d時就提升到了90%以上,之后一直維持在93%以上.這一階段中COD平均去除率達到94.82%,出水中VFAs含量(圖3)一直低于350mg/L,反應器內(nèi)pH7.4～7.8,說明這一階段反應器運行穩(wěn)定,處理效果良好.在反應器運行第57～67d,進水COD提升至大于70000mg/L,延長HRT至3.0d,有機負荷提升至 24.5kgCOD/(m3·d).這一階段,COD去除率持續(xù)下降,第67d下降至73.9%.同時,出水中VFA含量迅速升高至約10000mg/L,其中以丙酸和乙酸為主(圖3),反應器內(nèi)pH值下降至6.8.說明此階段反應器處于超負荷狀態(tài)運行,大量VFAs積累導致反應器內(nèi)出現(xiàn)酸化現(xiàn)象.

2.2 克隆文庫構(gòu)建和微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對反應器超負荷運行前后2個時期的厭氧顆粒污泥樣品(第56,67d樣品,分別定義為樣品A和B)進行微生物群落結(jié)構(gòu)的克隆文庫分析.古菌和細菌分別選取了約80個和140個陽性克隆子構(gòu)建克隆文庫.經(jīng)菌落PCR、酶切分類、測序后,獲得了樣品A和B的微生物群落結(jié)構(gòu)(表2).

圖2 EGSB反應器的運行Fig.2 Performance of the EGSB reactor

圖3 出水中VFA含量的變化Fig.3 Variation of VFAconcentrations in the effluent

表2 污泥樣品A和樣品B的克隆統(tǒng)計結(jié)果Table2 Cloneresultsof microbein sludgesampleA andB

對于樣品A,反應器在超負荷運行前,代表古菌的12個OTUs的79個克隆子被分為4類古菌：產(chǎn)甲烷髦毛菌(Methanosaetaceae)、產(chǎn)甲烷桿菌(Methanobacteriaceae)、產(chǎn)甲烷微菌(Methanomicrobiaceae)和產(chǎn)甲烷八疊球菌(Methanosarcinaceae),其優(yōu)勢菌群是產(chǎn)甲烷髦毛菌,含量為68.4%.古菌中豐度最高的克隆子A3(29/79)也屬于產(chǎn)甲烷髦毛菌,它與Methanosaeta concilii(CP002565)的序列相似性為99%,M.concilii可以利用小分子有機酸形成甲烷并且與厭氧顆粒污泥的形成有關(guān)[10],保障了EGSB反應器的穩(wěn)定運行.在產(chǎn)甲烷古菌中產(chǎn)甲烷髦毛菌與產(chǎn)甲烷八疊球菌屬于乙酸營養(yǎng)型甲烷菌,是厭氧產(chǎn)甲烷反應器中的最重要的古菌,乙酸營養(yǎng)型甲烷菌的含量的多少直接決定了厭氧反應器運行效果[11].

樣品A的細菌中,代表23個OTUs的131個克隆子被分為5類細菌：低GC革蘭氏陽性菌(Firmicutes)、高 GC革蘭氏陽性菌(Actinobacteria)、δ-變形菌、ε-變形菌、綠彎菌門(Chloroflexi),其中優(yōu)勢菌群是低GC革蘭氏陽性菌,含量為56.5%,高GC革蘭氏陽性菌含量為19.8%,是第2優(yōu)勢菌.細菌的菌群豐富度相比于一些以自配水為進水的厭氧生物反應器低很多[9,12],主要是由于垃圾滲瀝液中存在多種毒性物質(zhì)及生物抑制性物質(zhì)所導致的[3].樣品A取樣時,EGSB反應器以進水COD約55000mg/L,有機負荷約23 kgCOD/(m3·d)穩(wěn)定運行10d,COD平均去除率94.1%,說明在此負荷下,EGSB反應器可以穩(wěn)定運行(樣品A的系統(tǒng)發(fā)育樹沒有給出).

樣品B,其微生物群落結(jié)構(gòu)與樣品A相比發(fā)生了明顯的變化.對于古菌,優(yōu)勢菌群變?yōu)楫a(chǎn)甲烷微菌,其含量為51.9%,第2優(yōu)勢菌群是產(chǎn)甲烷桿菌,其含量為36.7%.產(chǎn)甲烷微菌和產(chǎn)甲烷桿菌均是氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,其總含量達到了88.6%.而在A樣品中處于古菌優(yōu)勢地位的產(chǎn)甲烷髦毛菌的含量降低至8.9%,另一類乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷八疊球菌的含量依舊很低,僅為2.5%.乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌含量的降低導致小分子有機酸(如乙酸、丙酸等)不能被迅速利用,造成有機酸的大量積累,反應器出現(xiàn)酸化現(xiàn)象.產(chǎn)甲烷古菌的生長周期較長,一般需要十幾天到幾十天[13],而本研究中反應的超負荷運行11d,沒有充足的時間使產(chǎn)甲烷古菌大量繁殖,古菌菌群中乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌含量的大幅度降低是由于產(chǎn)甲烷髦毛菌在超負荷狀態(tài)下大量死亡所導致的.

對于樣品B的細菌,代表12個OTUs的136個克隆子被分為2大類：低GC革蘭氏陽性菌和高GC革蘭氏陽性菌,其含量分別為56.6%和43.4%.而在樣品A中存在的屬于δ-變形菌、ε-變形菌和綠彎菌門的菌在樣品B中均沒有檢出.說明超負荷狀態(tài)下,屬于這些菌群的細菌的生長均受到了抑制.細菌中,豐度最高的操縱子OTU 2(40/136)屬于高 GC革蘭氏陽性菌,它與Atopobiumsp.ICM42b10(HQ616393)的序列相似度達100%.Atopobium是一種產(chǎn)酸菌,其代謝產(chǎn)物一般為乳酸或丙酸[14],它的大量存在導致反應器中丙酸大量產(chǎn)生.樣品B中的低GC革蘭氏陽性菌中,幾乎全部的克隆子都屬于Clostridiales,Clostridiales的很多子分支的菌種都是厭氧生物反應器中很常見的菌,其中有很多是產(chǎn)乙酸菌,同時Clostridiales普遍具有能產(chǎn)生芽孢的生物特性,以抵御惡劣的生存環(huán)境[15].樣品B的古菌及細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4,圖5所示.

2.3 討論

本研究的工藝處理垃圾焚燒廠滲瀝液在有機負荷為23.1kgCOD/(m3·d)時已接近反應器所能承受的有機負荷上限.同時,進水中的氨氮負荷、鈣負荷、毒性物質(zhì)濃度等也可能是引起反應器超負荷運行的原因[16].由反應器超負荷前后微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況可以看出,反應器在比較短的時間內(nèi)(11d),古菌和細菌的種群結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯變化,有較多的菌群在超負荷運行狀態(tài)下不能繼續(xù)生存,嚴重影響了反應器的處理效果.同時,由于垃圾滲瀝液的生物抑制作用,厭氧顆粒污泥的微生物種群多樣性較低,相對簡單的種群結(jié)構(gòu)抗沖擊能力較差,更容易受到外界環(huán)境變化帶來的影響.

圖4 樣品B的古菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of archaea in sludge sample B

圖5 樣品B的細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of eubacteria in sludge sample B

一般厭氧顆粒污泥對有機物的降解性能下降有2種原因：一是污泥中微生物的生物活性受到抑制導致的,二是污泥中微生物死亡導致的.由于古菌的生長周期較長,如果反應器處理效果的下降是由于古菌的大量死亡導致的,恢復反應器的運行效果則需要很長的時間[5].反應器內(nèi)VFAs的含量是衡量反應器運行狀態(tài)的直觀且迅速的指標,為防止反應器進入超負荷運行狀態(tài)時間過長導致污泥中功能微生物的大量死亡,應密切注意出水VFAs的含量變化.

克隆文庫法對混合菌群的群落結(jié)構(gòu)進行考察存在一定的誤差,比如由于克隆文庫中克隆子數(shù)量的因素帶來的偶然誤差.在實驗條件允許情況下,可以適當增加克隆子數(shù)量,減少偶然誤差.

3 結(jié)論

3.1 采用EGSB工藝處理垃圾焚燒滲瀝液在有機負荷低于23.1kgCOD/(m3·d)時COD去除率較高,平均達94.82%.進一步提高有機負荷,反應器進入超負荷狀態(tài),COD去除率顯著降低.

3.2 反應器超負荷運行前后,在較短時間內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化.古菌的優(yōu)勢菌群從產(chǎn)甲烷髦毛菌(68.4%)變?yōu)楫a(chǎn)甲烷微菌(51.9%);細菌的優(yōu)勢菌一直是低GC革蘭氏陽性菌,且大多數(shù)屬于Clostridiales目,具有形成芽孢的特性以抵御嚴格的生長環(huán)境.

3.3 反應器超負荷運行時出現(xiàn)的COD去除率下降以及出水VFA大量增高是由于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的大量死亡導致的,甲烷髦毛菌的含量在超負荷運行前后的含量從68.4%降低至8.9%,產(chǎn)甲烷八疊球菌的含量一直低于3%.

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