陳麗麗 張新日 李 陽

陳麗麗，張新日.卡托普利對大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織小窩蛋白-1表達(dá)的影響［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):46-50.

呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機(jī)械通氣的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點問題。據(jù)文獻(xiàn)報道，小窩蛋白-1(cavedin，Cav-1)在肺組織中的表達(dá)水平減低參與了VILI的發(fā)病過程，但其機(jī)制尚不明確［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞上Cav-1的表達(dá)水平受AngⅡ的調(diào)節(jié)［2］。但VILI時肺組織中Cav-1表達(dá)是否受AngⅡ的調(diào)節(jié)，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑能否增加Cav-1的表達(dá)水平尚有待深入研究。本實驗通過觀察血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑—卡托普利干預(yù)后大鼠肺組織AngⅡ及Cav-1表達(dá)量的變化，旨在探討卡托普利對大潮氣量機(jī)械通氣致大鼠急性肺損傷的防治作用。

材料與方法

一、動物分組與處理

24只雄性健康 Sprague-Dawley大鼠(體質(zhì)量300～350 g，山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，隨機(jī)分為3組，每組8只動物:①對照組:未行機(jī)械通氣;②大潮氣量組(H-VT組):VT:40 ml/kg;③卡托普利干預(yù)組(CAP組):通氣前30 min經(jīng)腹腔注射卡托普利(100 mg/kg)。

25%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開氣管插管術(shù)。除對照組外，余各組大鼠均與小動物呼吸機(jī)(DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造)相連行機(jī)械通氣。機(jī)械通氣參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置為:VT:40 ml/kg，f:60 次/min，I/E:1/3，PEEP 為0，吸入氣體為室內(nèi)空氣，通氣時間為2 h。

二、標(biāo)本收集與制備

通氣結(jié)束后，腹主動脈放血處死大鼠，完整切取肺臟。左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)(4℃生理鹽水灌注4 ml×4次，回收量大于80%)，支氣管肺泡灌洗液 (bronchialalveolarlavage fluid， BALF)經(jīng)3000 r/min離心10 min，取上清液－70℃凍存待測;取右肺上葉－70℃凍存，用于測定AngⅡ含量;取右肺中葉計算肺組織干/濕(W/D)比值;取右肺下葉用4%福爾馬林液固定，行石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法(SABC法)檢測肺組織Cav-1的表達(dá)水平。

三、檢測方法

1.肺組織W/D比值測定:取右肺中葉，用生理鹽水沖洗干凈表面血跡，無菌紗布吸干表面液體后稱重(即濕重)，后置于60℃烤箱中過夜，再稱重(即干重)，計算肺組織W/D比值。

2.BALF中總蛋白(TP)含量測定:采用BCA法(試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供)測定BALF中TP含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

3.肺組織中AngⅡ含量測定:將右肺上葉置于裂解液中，用組織勻漿機(jī)打碎后離心，取上清液用ELISA法檢測肺組織中AngⅡ含量(試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司)，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。在酶標(biāo)儀(wellscan Mk3，芬蘭)上測出標(biāo)準(zhǔn)品吸光度后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測得的樣品吸光度數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品含量。

4.肺組織Cav-1表達(dá)測定:采用免疫組織化學(xué)法(SABC)測定肺組織Cav-1的表達(dá)。嚴(yán)格參照試劑盒說明書(試劑盒購自Cell Signaling Technology)進(jìn)行操作。兔抗大鼠抗體工作濃度為1︰800，以磷酸鹽緩沖液(phosphate duffer sdution，PBS)代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷:細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性染色。在400倍光學(xué)顯微鏡下對每張組織切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野的光密度值，取上述5個視野的平均光密度值作為該組大鼠肺組織Cav-1表達(dá)的相對含量。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺組織病理學(xué)改變

HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察，對照組大鼠各級支氣管上皮和肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔正常，肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤。H-VT組大鼠可見大量炎性細(xì)胞浸潤和彌漫性肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有血性液體且有炎性細(xì)胞浸潤。CAP組大鼠肺也可見到炎性細(xì)胞浸潤和肺泡間隔增厚，但較H-VT組明顯減輕(圖1～3)。

圖1 對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔基本正常(HE×250)

圖2 H-VT組大鼠肺泡間隔彌漫性水腫、增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有血性液體滲出及炎性細(xì)胞浸潤(HE×250)

圖3 CAP組大鼠肺泡間隔度輕度水腫、增厚，少部分肺泡破裂融合，肺泡腔見少量炎性細(xì)胞浸潤(HE×250)

二、肺組織W/D比值測定結(jié)果

各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，與對照組相比，H-VT組和CAP組大鼠肺組織W/D比值均明顯升高(均P＜0.01)，但CAP組大鼠肺組織W/D比值較H-VT組明顯減低(P＜0.01)。

表1 各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n W/D 比值對照組84.0625 ±0.27322 H-VT 組 8 7.1875 ±0.34112a CAP 組 8 4.8913 ±0.43927ab

三、BALF中TP含量測定結(jié)果

各組大鼠BALF中TP含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，與對照組相比，H-VT組和CAP組大鼠BALF中TP含量均明顯升高(均P＜0.01)，但CAP組大鼠BALF中TP含量較H-VT組明顯減低(P＜0.01)。

表2 各組大鼠BALF中TP測定結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠BALF中TP測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n BALF中TP 含量對照組80.2238 ±0.03662 H-VT 組 8 0.5413 ±0.05463a CAP 組 8 0.4550 ±0.06568ab

四、肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果

各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，CAP組和對照組大鼠肺組織AngⅡ含量相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但H-VT組大鼠肺組織AngⅡ含量均明顯高于對照組和CAP組(均P＜0.01)。

表3 各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果(±s)

表3 各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n 肺組織AngⅡ含量對照組8116.7500 ±11.39078 H-VT 組 8 376.0100 ±21.43080a CAP 組 8 132.2563 ±14.35712ab

五、肺組織Cav-1表達(dá)水平測定結(jié)果

各組大鼠肺組織Cav-1表達(dá)水平測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，H-VT組Cav-1表達(dá)水平均明顯低于對照組和CAP組(均P＜0.01)，CAP組大鼠肺組織 Cav-1表達(dá)水平低于對照組(P＜0.01)，(圖4～6)。

表4 各組大鼠肺組織Cav-1表達(dá)量測定結(jié)果(±s)

表4 各組大鼠肺組織Cav-1表達(dá)量測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n Cav-1表達(dá)量對照組80.55625 ±0.039856 H-VT 組 8 0.27875 ±0.048544a CAP 組 8 0.43688 ±0.06312ab

圖4 對照組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

圖5 H-VT組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

圖6 CAP組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

六、肺組織Cav-1與AngⅡ含量的相關(guān)性分析各組大鼠肺組織Cav-1與肺組織AngⅡ含量之間呈負(fù)相關(guān)(r= －0.821，P＜0.01)。

討 論

近年來通過對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞膜上存在直徑約50～100 nm的囊性凹陷結(jié)構(gòu)—小窩(caveolae)，其不僅參與跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，而且是細(xì)胞信號分子富集和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐［3］。小窩蛋白(caveolae pratein)是小窩的主要結(jié)構(gòu)蛋白和活性成分，其中cav-1廣泛存在于肺組織中［4］。研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1通過其“腳手架”域與多種下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用，調(diào)節(jié)其活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到適宜刺激后，Cav-1隨即激活，與其相耦聯(lián)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)［3］。

有研究表明，Cav-1通過中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，CO在機(jī)械通氣過程中發(fā)揮的抗炎保護(hù)作用部分是通過誘導(dǎo)Cav-1高表達(dá)實現(xiàn)的［1］。與野生型小鼠相比，Cav-1基因敲除小鼠在機(jī)械通氣后肺組織損傷程度明顯加重，其支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量和細(xì)胞計數(shù)比野生型小鼠升高3～5倍。因此我們推測，Cav-1在機(jī)械通氣過程中可能通過調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性，參與VILI的發(fā)病過程，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

近年來，腎素 －血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)在急性肺損傷中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，其中以AngⅡ及其1型受體的作用最為突出［5-9］。研究發(fā)現(xiàn)，大潮氣量機(jī)械通氣所致急性肺損傷與RAS系統(tǒng)激活有關(guān)，使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑均可減輕肺損傷程度，但RAS系統(tǒng)激活是否與Cav-1信號通路有關(guān)目前尚無定論［5］。

本實驗研究顯示:H-VT組大鼠肺組織AngⅡ含量、肺組織W/D比值及BALF中TP含量均明顯高于對照組，而肺組織Cav-1的表達(dá)水平明顯低于對照組，且大鼠肺組織中Cav-1表達(dá)水平與AngⅡ含量之間呈負(fù)相關(guān)。說明AngⅡ可通過下調(diào)Cav-1在肺組織中的表達(dá)水平，在VILI發(fā)病機(jī)制中起一定作用。其作用機(jī)制可能是機(jī)械牽拉刺激使肺組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性升高，生成大量AngⅡ，后者通過某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)Cav-1的表達(dá)水平，從而使Cav-1對其相耦聯(lián)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的抑制作用減弱，最終激活多種炎性細(xì)胞并產(chǎn)生大量致炎因子，導(dǎo)致肺組織的損傷。

卡托普利屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，減少AngⅡ的生成，可減輕由AngⅡ所引起的肺組織炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，CAP組大鼠肺組織病理損傷程度較H-VT組明顯減輕，同時其肺組織AngⅡ含量、肺組織W/D比值、BALF中TP量均較H-VT組明顯降低，而肺組織Cav-1的表達(dá)水平較H-VT組明顯增加。說明卡托普利可通過抑制AngⅡ生成，進(jìn)而上調(diào)Cav-1的表達(dá)水平，對VILI具有一定保護(hù)作用。

綜上所述，機(jī)械刺激可使肺組織AngⅡ生成增多，后者通過下調(diào)肺組織Cav-1的表達(dá)水平參與VILI的發(fā)病過程。卡托普利通過抑制AngⅡ生成，上調(diào)肺組織Cav-1的表達(dá)水平，對VILI具有一定的防治作用。但AngⅡ通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控肺組織Cav-1的表達(dá)水平尚有待深入研究。

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