曹 婷，施力光，張立嶺，荀文娟，周漢林，黃顯州，侯冠彧＊

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，海南 儋州571737；2.海南大學 農(nóng)學院，海南 ?？?70228）

豬肌肉生長發(fā)育和產(chǎn)肉性狀形成分子機制一直是動物遺傳育種領域關注的重點，解析產(chǎn)肉性狀形成的分子機制，是有效開發(fā)利用地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和培育優(yōu)良新品種的關鍵［1］。五指山豬在作為模式動物研究的同時，其優(yōu)良種質(zhì)特性，如背肌厚、脂肪含量低、風味氨基酸含量高等作為特色高檔肉食品開發(fā)意義重大，但是具有生長慢、體型小的缺點［2］。本試驗以五指山豬和生長速度較快但肉質(zhì)稍差的長白豬為研究對象，分析肌生成調(diào)控因子MRFs基因家族成員在以上兩種豬妊娠期65 d胎兒組織中mRNA表達情況，為探索肌肉生長發(fā)育差異機制、系統(tǒng)選育及控制體型大小提供參考［3-4］。

肌生成調(diào)控因子MRFs基因家族在動物肌肉形成和發(fā)育過程中起著至關重要的調(diào)節(jié)作用。MRFs基因家族成員包括Myo D 1、Myf4、Myf5和Myf6四種基因，其中Myo D1和Myf5最先表達，主要負責調(diào)控肌細胞的增值和調(diào)節(jié)生肌細胞系的定向作用，隨后Myf4和Myf6基因進一步完成肌纖維的形成，它們的缺失可以直接或者間接導致肉品質(zhì)和產(chǎn)肉量的降低［5-7］。因此，對MRFs基因家族成員在不同組織表達量的研究，可以為進一步提高肉品質(zhì)和肉產(chǎn)量提供一定理論依據(jù)，同時為進一步深入研究影響五指山豬或其他動物生長發(fā)育和體型大小機制提供借鑒［3-4］。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院實驗豬場妊娠期65 d五指山豬和長白豬各一頭，快速處死，將胎盤取出，分別采集2個胎兒不同組織，放于液氮，備用。

1.2 試劑及儀器

主要試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq TM）均購自大連寶生物工程有限公司；主要儀器：核酸濃度測定儀（Nano Vue，美國GE），PCR儀（Biometra），凝膠成像系統(tǒng)，小型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf）、熒光定量PCR儀（德國Eppendorf），SA-960-2超凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司），移液槍（physiocare），熒光定量PCR八聯(lián)管套裝（Axygen）。

1.3 qPCR

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 按試劑盒說明提取各組織總RNA，核酸紫外分光光度計檢測濃度及純度，稀釋備用。

反轉(zhuǎn)錄：Total RNA 0.5μL；Prime Script TM RT Enzyme MixⅠ0.5μL；5×prime Script TM Buffer終濃度1×；Random 6 mers終濃度50 pmol；Oligo d T Primer終濃度 25 pmol；RNase Free d H2O Up to 10μL。37℃，15 min；85℃，5 s。放于-20℃冰箱待用。

1.3.2 引物 Primer5設計引物，上海生工生物合成，見表1。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Real time RT-PCR primer information

1.3.3 qPCR 試 驗 采 用 realplex4qPCR 儀，SYBR Green I染料二步法，25μL反應體系：SYBR?Premix Ex Taq TM 12.5μL，引物1μL（10 μmol／L），c DNA模板2μL，dd H2O 9.5μL。預熱95℃60 s，變性95.0℃10 s；退火61℃20 s；循環(huán)40次。

1.4 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

參考 Winer等的方法［8］，在保證以上四種基因擴增效率的前提下，分別以各個基因在五指山豬胎兒腿部骨骼肌中的表達水平為標準量，2-△△Ct法結(jié)合內(nèi)參基因運算目的基因相對mRNA表達情況（每個基因都有個Ct值，即熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；△Ct＝目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct；△△Ct＝標準量的△Ct與其他△Ct的差；相對表達量則為2-△△Ct）。SAS軟件數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

MRFs基因家族成員在五指山豬與長白豬65 d妊娠期胎兒各組織中m RNA相對表達情況分析結(jié)果見圖1～4。

試驗結(jié)果表明，MRFs家族成員除在肝、腎、腸組織以外，在五指山豬65 d胎兒組織中mRNA表達水平均高于長白豬65 d胎兒相應組織中的表達水平（P＜0.05）；mRNA表達水平在腿肌和背肌中的表達普遍偏高，其他組織中表達較低（P＜0.05）；2個豬種在以上10種組織中MRFs家族mRNA表達水平高低分布基本一致，在腿部和背部骨骼肌及肝臟、肺和胃組織MRFs基因家族mRNA表達量較高，腎、腸和心臟中的表達量較低，相對表達量高低順序為：腿部骨骼肌＞背部骨骼?。靖危痉危疚福酒ⅲ灸X＞腎＞腸＞心。

圖1 Myo D1基因在五指山豬和長白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對表達水平Fig.1 MyfoD1 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖2 Myf4基因在五指山豬和長白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對表達水平Fig.2 Myf4 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖3 Myf5基因在五指山豬和長白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對表達水平Fig.3 Myf5 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖4 Myf6基因在五指山豬和長白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對表達水平Fig.4 Myf6 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

3 討 論

目前，中國是世界上最大的養(yǎng)豬和豬肉產(chǎn)品消費國。隨著人們生活水平的不斷提高，對豬肉的要求也日益增大，豬的生長速度和瘦肉率的提升也越顯重要，但目的性的選育難免會降低其他相關肉品質(zhì)，所以越來越多的肉品質(zhì)優(yōu)化問題日益顯著起來［9］。五指山豬原產(chǎn)于海南，具有遺傳穩(wěn)定、抗逆性強、背肌厚、膘少、代謝率低、氨基酸組成豐富等諸多特點［3-4］，但缺點是體形矮小、生長緩慢［2］。長白豬原產(chǎn)于丹麥，具生長速度快、體型大、屠宰率高等優(yōu)點［3-4］，缺點是肉質(zhì)欠佳［10］。不同品種的豬各具優(yōu)缺點，如何結(jié)合相應優(yōu)點培育出滿足消費者要求的品種是改善和提升肉品質(zhì)的關鍵。本試驗通過熒光定量等方法比較和分析五指山豬和長白豬妊娠65 d胎兒腿部、背部骨骼肌及各內(nèi)臟器官組織中控制肌肉生成和發(fā)育的MRFs基因家族的mRMA的表達差異，結(jié)果顯示除肝、腎和腸以外，MRFs基因家族m RMA的表達在五指山豬胎兒組織中普遍高于長白豬胎兒組織中的表達，且兩種豬肌肉組織中的表達差異明顯。因此，導致五指山豬和長白豬肉品質(zhì)和生長速度及體型的差異很可能與MRFs基因家族表達的差異有直接關系。對日后深入研究控制肌肉生長、發(fā)育機理和肉質(zhì)性狀發(fā)育，以及為控制豬種體型大小的形成機理提供理論依據(jù)。

肉品質(zhì)性狀的表現(xiàn)很復雜，受遺傳及環(huán)境影響。遺傳因素表現(xiàn)在動物出生前骨骼肌的形成，由肌纖維構(gòu)成，形成過程在妊娠期70 d左右完成，出生后只增大肌纖維體積，數(shù)量并不增加［2-4，11］。肌肉的形成和日后的生長主要由MRFs基因家族成員調(diào)控［3-6］。MRFs基因家族分為兩類，一類是先表達的Myo D1和Myf5基因，稱為初級MRFs，表達在成肌細胞增殖過程中，在生肌細胞系的定向中起調(diào)節(jié)作用；一類是 MyoG 及Myf6基因，稱為次級MRFs，對肌纖維的形成具有進一步完成作用［3-5，7］。在胚胎發(fā)過程中，Myf5是肌細胞中最先被誘導表達的基因，接下來表達的是 Myo D1、Myf5與Myo D1，它們之間有互補代償作用，兩種基因同時缺失會導致分化和形成的骨骼肌和成肌細胞不出現(xiàn)。由此可見，Myf5與MyoD1基因在肌肉形成上的重要作用［3-4，11-12］。Myf4是唯一在骨骼肌細胞系中都能表達的MRFs成員，在肌細胞分化中的正調(diào)控作用不可替代，調(diào)控肌細胞融合的起始，促進肌細胞的增殖，進一步使單核成肌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪思±w維，決定骨骼肌特異表型，并影響產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)［3，4，13-18］。Myf4 的位點突變會影響氨基酸序列、功能或改變該基因在胚胎發(fā)育時期的表達方式及水平，直接影響產(chǎn)肉量［3，4，19-22］。Myf6的作用及機理更加復雜，它的激活主要存在于動物出生后，具有促進次級肌纖維形成的調(diào)節(jié)作用，并在肌肉表型維持和肌纖維形成起著重要作用，是唯一能存在于成熟神經(jīng)節(jié)中的MRFs成員。Myf6基因與MyoG基因有很大的同源性，共同控制肌肉的分化。在肌肉的分化過程中這兩個基因幾乎同時表達，Myf6的自身突變能影響Myf5的表達，可以間接影響肌肉的產(chǎn)量［3-4，23］。本研究結(jié)果顯示，無論在五指山豬胎兒還是在長白豬胎兒組織中，都是在骨骼肌中MRFs基因家族的mRNA的表達水平最高，且明顯高于其他組織，說明該基因家族在肌肉的發(fā)育行程中起到了重要的正向調(diào)節(jié)作用；MRFs基因家族的基因在五指山豬胎兒肌肉中的mRNA表達普遍高于在長白豬胎兒骨骼肌中的表達，表明不同豬種間肌肉發(fā)育的差異與MRFs基因家族的表達水平的差異可能有直接聯(lián)系。這些結(jié)果有可能體現(xiàn)MRFs基因家族在肌肉組織生成和發(fā)展的關鍵作用的依據(jù)，以及為MRFs的表達水平導致肉質(zhì)性狀不同提供參考。因此，研究MRFs基因家族成員的作用機理和互作關系為日后進一步了解肌肉和其他組織的生長發(fā)育和變化規(guī)律提供一定的參考。

［1］ 王軍軍.不同豬種間MRFs家族及OB基因的結(jié)構(gòu)差異［D］.吉林長春：中國人民解放軍軍需大學，2003.

［2］ 侯冠彧，周漢林，王東勁，等.五指山豬8種組織IGF2和IGFBP3基因［J］.家畜生態(tài)學報，2010，31（5）：9-12.

［3］ 曹 婷，侯冠彧，施力光，等.五指山豬不同組織中 Myf5與MyoD1基因的表達研究［J］.家畜生態(tài)學報，2012，33（5）：1-4.

［4］ 曹 婷，施力光，周漢林，等.五指山豬不同組織中肌細胞生成素基因Myf4及生肌調(diào)節(jié)因子Myf6的表達［J］.基因組學與應用生物學2012，31（5）：1-5.

［5］ 楊明娟，陳 宏.牛MRFs基因家族研究進展［J］.中國牛業(yè)科學，2010，36（6）：51-55.

［6］ 劉丑生，趙興波，李 寧，等.動物肌肉生長發(fā)育調(diào)控的功能基因研究進展［J］.中國畜牧雜志，2003，39，（5）：48-49.

［7］ 湯展毅，嚴云勤，高學軍，等.牛Myf6基因克隆及在成纖維細胞中的表達［M］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，41（11）：77-82.

［8］ Winer J，Jung C K S，Shackel I，et al.Development and Validation of Real-Time Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction for Monitoring Gene Expression in Cardiac Myocytesin Vitro［J］.Analytical Biochemistry，1999，270：41-49.

［9］ 楊曉靜.豬骨骼肌生長及及纖維類型分布的分子機理研究［D］.江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2004.

［10］ 單立莉，張 敏，苗志國，等.Myogenin mRNA豐度在金華豬和長白豬背最長肌中的表達［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29（5）：374-388.

［11］ 丁國杰，劉 娣，李景芬.豬Myf5基因外顯子1的多態(tài)性分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（3）：125-127.

［12］ Daumas G，Dhorne T.Teneur en viande maigre des carcasses deporc：E′valuation et estimation［J］.Journe′es de la Recherche Porcine en France，1997，29：411-418.

［13］ Hasty P，Bradley A，Morris J H，et al.Muscle deficiecy and neonatal death in mice with a targeted muation in the myogenin gene［J］.Nature，1993，364：501-506.

［14］ Wright W E.Sassoon D A，V K Lin.Myogenin afactor regularing myogenesis has a domain homologous to MyoD［J］.Cell，1989，56（4）：607-617.

［15］ Olson E N.Molecular control of myogenesis：antagnonism between growth differentiation［J］.Molecucar Cell Biochemical，1991，104：7-13.

［16］ 林萬華，黃路生，艾華水，等.MyoG基因型對二臉花豬早期生長性狀及肌肉組織學特征的影響［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2002，10（4）：367-372.

［17］ 王 珊，陳 宏，蔡 欣.牛MyoG基因啟動子的克隆與序列分析［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2006，34（8）：12-16.

［18］ 張力鵬，張 東，蔡 欣.牛MRF4基因的電子克隆與分析［J］.中國牛業(yè)科學，2007，33（6）：1-4.

［19］ 趙 進，聶光軍，張金枝，等.MyoG基因?qū)鹑A豬繁殖性狀的影響［J］.遺傳，2005，27（6）：893-897.

［20］ Hughes S M，Schiaffino S.Control of muscle fibersize：a crucial factor in ageing［J］.Acta Physiologica Scandinavica，1999，167：307-312.

［21］ Naidu P S，Ludolph D C，To R Q，et al.Myogenin and MEF2 function synergistically to activate the MRF4 promoter duringm yogenesis［J］. Molecular and Cellular Biology，1995，15（5）：2 707-2 718.

［22］ Buonanno A，Edmondson D C，W P Hayes.Upstream sequences of the myogenin gene convey responsiveness to skeletal muscle denervation in transgenic mice［J］.Nucleic Acids Research，1993，21（24）：5 684-5 693.

［23］ Schnapp E，Pistocchi A S，Karampetsou E.Induced early expression of mrf4 but not myog rescues myogenesis in the myod／myf5 double morphant zebrafish embryo［J］.Journal of Cell Science，2009，122：481-488.