程秀娟 熊國平 汪 琳

（1河南中醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，鄭州450008；2武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430014；3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，武漢430071）

輸卵管是重要的生殖器官，是配子運送、受精以及早胚發(fā)育的場所［1］。精卵結(jié)合形成受精卵、卵裂的發(fā)生、早胚的發(fā)育等一系列程序化的發(fā)育過程都在輸卵管中進行，與輸卵管微環(huán)境相互作用，并按其特定的程序逐漸發(fā)生。哺乳動物包括人的生殖周期中，伴隨血清雌孕激素水平的周期性波動，輸卵管粘膜的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生周期性的變化［2］。輸卵管的組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變，將影響受精卵的發(fā)育和運送，導(dǎo)致異位妊娠的發(fā)生。輸卵管妊娠是最常見的異位妊娠。輸卵管妊娠嚴重危害婦女的生命和健康，因此研究其發(fā)生機制有著重要意義.現(xiàn)已知，正常輸卵管β－tubulin的表達分泌期強于增生期，妊娠輸卵管中β－tubulin的表達比分泌期減弱，β－tubulin在妊娠輸卵管組織中的低表達可能是輸卵管妊娠的影響因素［3］，但β－tubulin在輸卵管妊娠著床部位與非著床部位的表達如何，目前未見報導(dǎo)。本實驗檢測β－tubulin在輸卵管妊娠著床部位與非著床部位的表達，為進一步明了輸卵管妊娠的發(fā)生機制提供重要的實驗資料。

材料和方法

1.材料

收集武漢市中心醫(yī)院2004年2月－2005年2月臨床和病理確診為輸卵管妊娠的部分輸卵管組織20例及因子宮良性腫瘤手術(shù)切除的部分正常輸卵管組織20例。兩組均要求患者平時月經(jīng)周期規(guī)律，輸卵管妊娠患者要求無盆腔炎和盆腔手術(shù)操作史及未使用宮內(nèi)節(jié)育器史。

2.主要試劑

鼠抗人微管蛋白β單克隆抗體濃縮液，鏈霉素抗生物蛋白－過氧化物酶連結(jié)（SP）試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京中山生物技術(shù)公司。

3.方法

3.1 標(biāo)本處理 將手術(shù)切除的正常輸卵管及異位妊娠輸卵管組織立即置于4%中性甲醛固定24h，取材（妊娠輸卵管分別取著床部位與非著床部位），常規(guī)酒精逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。切片厚度為4μm，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，待作常規(guī)HE染色及免疫組化染色。

3.2 HE染色及光學(xué)顯微鏡觀察 各例標(biāo)本作常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察正常輸卵管、妊娠輸卵管組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，根據(jù)臨床資料及光鏡特點將正常輸卵管組織分為增生期組和分泌期組。選取正常輸卵管分泌期，輸卵管妊娠著床部位與非著床部位三組做免疫組化染色。

3.3 檢測方法 采用鏈菌素抗生物素蛋白－過氧化物酶免疫組化法（S－P法）分別檢測正常輸卵管分泌期、輸卵管妊娠著床部位與非著床部位β－tubulin的表達。用PBS液代替一抗作陰性對照。實驗步驟按SP試劑盒說明書進行。

3.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞著色情況，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，空白對照為陰性。

4.定量分析

采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)檢測，測定各組免疫組化反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度。

5.統(tǒng)計學(xué)處理

對各項免疫組化反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度作t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

結(jié) 果

β－tubulin陽性表達為棕黃色，定位于細胞質(zhì)。輸卵管上皮細胞、平滑肌細胞、纖維細胞和炎細胞等為陽性表達，輸卵管上皮細胞中的纖毛細胞纖毛部著色尤為明顯。紅細胞為陰性表達。

正常輸卵管分泌期組織、輸卵管上皮細胞、平滑肌細胞和纖維細胞等染色呈深棕黃色（圖1），輸卵管妊娠非著床部位輸卵管上皮細胞、平滑肌細胞和纖維細胞等染色較正常輸卵管分泌期組織減弱（圖2），輸卵管妊娠著床部位輸卵管上皮細胞、平滑肌細胞和纖維細胞等染色淺淡，較輸卵管妊娠非著床部位進一步減弱（圖3↑，↑所指區(qū)域以外為輸卵管妊娠破裂釋放物）。陰性對照組所有組織及細胞均未見著色。圖像分析結(jié)果顯示：輸卵管妊娠非著床部位粘膜上皮中的β－tubulin的表達比正常輸卵管分泌期減弱；輸卵管妊娠著床部位β－tubulin的表達比非著床部位減弱（表1）。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 輸卵管妊娠著床與非著床部位β－tubulin表達的平均光密度值（±s）Table 1 The average optical density ofβ－Tubulin in implantation or non implantation site of pregnant oviduct（±s）

表1 輸卵管妊娠著床與非著床部位β－tubulin表達的平均光密度值（±s）Table 1 The average optical density ofβ－Tubulin in implantation or non implantation site of pregnant oviduct（±s）

＊和△與對照組比較（compared with control group）P＜0.05

Group β－Tubulin Secretory phase oviduct（control）0.17718±0.00092 Non implantation site of pregnant oviduct 0.17401±0.00125＊Implantation site of pregnant oviduct 0.17287±0.00110△

圖1 β－tubulin在正常輸卵管分泌期粘膜上皮（↑示上皮）中的強表達。SP×200圖2 β－tubulin在輸卵管妊娠非著床部位粘膜上皮（↑示上皮）中的表達弱于正常輸卵管分泌期。SP×200圖3 β－tubulin在輸卵管妊娠著床部位的粘膜上皮（↑示上皮）中的表達弱于非著床部位。SP×200Fig.1 The strong expression ofβ－tubulin in the mucosal epithelium of normal oviduct of secretory phase.SP×200Fig.2 The positive expression ofβ－tubulin in the non implantation site of pregnant oviduct was lower than that in the secretory phase of normal tubal tissue.SP×200Fig.3 The positive expression ofβ－tubulin in the implantation site was lower than that in the non implantation site of pregnant oviduct.SP×200

討 論

細胞骨架系統(tǒng)不僅維持細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整，而且通過與其他細胞之間特異或非特異性地相互作用，在傳遞壓力和張力及感知微環(huán)境物理作用方面起重要作用［4］，是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)裝置［5］。微管系統(tǒng)是細胞骨架的重要組成部分，微管是由α－微管蛋白（α－tubulin）和β－微管蛋白（β－tubulin）兩個亞基組成的微管蛋白異二聚體縱向排列而成的中空管狀結(jié)構(gòu)，大多數(shù)微管都表現(xiàn)出動力學(xué)的不穩(wěn)定性，以動態(tài)的聚合、解聚及兩者之間隨機轉(zhuǎn)換的形式存在［6］。微管多存在于細胞質(zhì)中，是纖毛、鞭毛等運動性結(jié)構(gòu)的組成部分，主要參與細胞運動、細胞器的定位、胞內(nèi)物質(zhì)的運輸及真核細胞的有絲分裂過程，對細胞有支持和運動作用。實驗采用免疫組化的方法檢測β－tubulin在正常輸卵管分泌期、輸卵管妊娠著床部位與非著床部位的表達。結(jié)果顯示：正常輸卵管分泌期β－tubulin的表達強于輸卵管妊娠非著床部位；輸卵管妊娠著床部位β－tubulin的表達比非著床部位明顯減弱。輸卵管上皮由分泌細胞和纖毛細胞構(gòu)成，分泌細胞的分泌物構(gòu)成輸卵管液，可營養(yǎng)卵，輔助卵的運行，纖毛細胞的纖毛向子宮方向擺動，以及平滑肌的蠕動可將卵推向子宮，這對配子和早胚在輸卵管中的運送起著重要的作用。我們推測，可能由于某種原因?qū)е娄拢璽ubulin在輸卵管分泌期的表達異常降低，使分泌細胞的分泌以及纖毛細胞、平滑肌細胞的活動受到抑制，分泌減少使輸卵管液的量及成分發(fā)生改變而影響早胚的營養(yǎng)發(fā)育和運送，纖毛的擺動減弱以及平滑肌的蠕動減弱，對早胚的運送減慢，使胚泡滯留于輸卵管。細胞骨架接受胞外信號，對化學(xué)信號和物理信號產(chǎn)生應(yīng)答。細胞骨架可探測細胞外基質(zhì)的力學(xué)特性，胞外物理介質(zhì)反過來又會影響細胞骨架的組裝［7］。微管受到外力時，隨著外力的增加，完全解聚的可能性增大［8］。胚泡滯留于輸卵管后錯誤粘附于輸卵管上皮，并對輸卵管著床部位產(chǎn)生一定的壓力。著床部位的輸卵管組織細胞在接受了胚泡粘附和壓力的信號后，通過調(diào)控機制使該區(qū)域組織細胞微管解聚，β－tubulin表達減低，細胞的剛性降低，細胞易于變形，使胚泡更易于在組織中移動，使胚泡在著床部位向深處浸潤。導(dǎo)致異位著床的因素很多，β－tubulin表達的降低可能是其中的影響因素之一。

［1］Magdalena Nutu，Birgitta Weijdeg?rd，Peter Thomas，et al.Distribution and hormonal regulation of membrane progesterone receptorsβandγin ciliated epithelial cells of mouse and human fallopian tubes.Reproductive Biology and Endocrinology，2009，7：89 doi：10.1186／1477－7827－7－89

［2］楊剛 主編.內(nèi)分泌生理與病理生理學(xué).1994年，第三版，天津科學(xué)技術(shù)出版社，525

［3］熊國平，程秀娟，汪琳等.β－tubulin在正常及妊娠輸卵管組織中的表達.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2007，16（6）：706－709

［4］Janmey PA，McCuiioch CA.Cell mechanics：integrating cell responses to mechanical stimuli.Annu Rev Biomed Eng，2007，9（1）：1－34

［5］Han X，Li Z，Chen H，et al.Influenza Virus A／Beijing／501／2009（H1N1）NS1 Interacts with b－Tubulin and Induces Disruption of the Microtubule Network and Apoptosis on A549 Cells，PLoS ONE 2012，7（11）：e48340

［6］Toshiyuki O，Nobutake H，Masahide K.Three－dimensional structures of the flagellar dynein－microtubule complex by cryoelectron microscopy.J Cell Biol，2007，177（2）：243－252

［7］Discher DE，Janmey P，Wang YL.Tissue cells feel and respond the stiffness of their substrate.Science，2005，310（5751）：1139－1143

［8］Wang N，Tytell JD，Ingher DE.Mechanotransduction at a distance：mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.Nature Rev Mol Cell Biol，2009，10（1）：75－82