唐 甜 陳小希 張端蓮

（1武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 湖北430060；2湖北省地質(zhì)職工醫(yī)院 武漢430072；3武漢大學基礎醫(yī)學院組織胚胎教研室 湖北430071）

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性血管腫瘤，它是一種由血管形成異常而引起的疾病，其特點是通過未成熟的內(nèi)皮細胞彌散增殖而在出生后快速生長，之后自發(fā)消退。血管內(nèi)皮細胞異常增殖是血管瘤的主要組織學特點［1－3］。雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退，但是一些血管瘤病變嚴重損壞正常組織，產(chǎn)生并發(fā)癥。目前的治療方法的成效很有限，一些治療方法的副作用也限制了其應用。深入研究和了解血管瘤的發(fā)病機理將為治療血管瘤提供更好的治療手段。

EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅zeste基因增強子（E（z））的人類同源物，是PcG（Poly comb Group）基因家族的重要成員之一。在PcG基因家族中，EZH2起著核心作用。目前已在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EZH2表達增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并發(fā)現(xiàn)EZH2高表達與腫瘤的進展和預后差相關［4，5］。CBX7（ehromobox homolog 7）與黑腹果蠅的異染色質(zhì)蛋白（Heteroehromatin Protein，HPI）具有同源性，主要分布于染色質(zhì)、核，其分子功能通過與染色質(zhì)結合實現(xiàn)。目前已有研究表明CBX7在腫瘤細胞中有表達［6］。

本文通過應用免疫組織化學方法和圖像分析技術檢測血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中EZH2和CBX7的表達水平，以探討其在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為臨床上治療血管瘤提供更多參考和指導。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來源

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2005年9月－2009年12月皮膚毛細血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性25例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標本進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學S－P法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標準并結合PCNA的表達進行分組：石蠟標本中增生期血管瘤26例，退化期血管瘤24例。另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人EZH2和CBX7單克隆抗體（購于北京中杉生物技術有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術有限公司）。

2.方法

2.1 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色

2.2 免疫組織化學SP法檢測EZH2和CBX7相關抗原

2.2.1 具體步驟：

（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復（檸檬酸緩沖液微波抗原修復法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為EZH2和CBX7的陽性對照組。

2.2.2 免疫組織化學結果判斷

（1）EZH2和CBX7都是以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對EZH2和CBX7的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應的總面積／單位面積中細胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗，檢驗水準α為0.05。

結 果

1.EZH2的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，EZH2表達強（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達弱或無表達（圖2）；正常皮膚組血管內(nèi)皮細胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達弱或無表達（圖3）。圖像分析結果見表1。增生期組EZH2的表達明顯高于退化期組和正常皮膚組 （P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 血管瘤不同時期EZH2表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

表1 血管瘤不同時期EZH2表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 26 0.3201±0.0056＊ 0.3650±0.0058＊退化期組Involuting Group 24 0.0584±0.0026△ 0.0815±0.0029△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.0520±0.0024▲ 0.0793±0.0027▲

2.CBX7的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，CBX7表達強（圖4）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達弱或無表達（圖5），正常皮膚組血管內(nèi)皮細胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達弱或無表達（圖6）。圖像分析結果見表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細胞的表達顯著高于退化期血管瘤內(nèi)皮細胞和正常皮膚組（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同時期CBX7表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

表2 血管瘤不同時期CBX7表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 26 0.3014±0.0049＊ 0.3593±0.0052＊退化期組Involuting Group 24 0.0675±0.0027△ 0.0751±0.0030△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.0601±0.0025▲ 0.0721±0.0029▲

討 論

皮膚血管瘤是常見的血管腫瘤之一，以毛細血管內(nèi)皮細胞異常增殖為主要組織學特點。大多數(shù)血管瘤的生長經(jīng)歷三個時期，即增生期、退化期及退化完成期。增生期是在血管瘤發(fā)病初期幾個月內(nèi)，表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞過度增殖，以大量毛細血管內(nèi)皮細胞快速增殖和血管異常形成為典型特征；隨后，增殖期血管瘤進入漫長的退化期，該期血管瘤內(nèi)皮細胞出現(xiàn)大量凋亡，細胞外基質(zhì)纖維和脂肪組織增生，替代血管瘤增生組織；退化期持續(xù)約數(shù)月到數(shù)年，而后進入退化完成期［7－8］。

一般認為，血管瘤是血管生長及修復的紊亂，其主要的特征是毛細血管的內(nèi)皮細胞增生。這也與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，即細胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等相一致［9］。

EZH2基因是1996年發(fā)現(xiàn)的一種新的人類基因，EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅基因增強子（E（z））的人類同源物，是PcG家族的重要成員之一。作為一種重要的PcG蛋白，EZH2參與染色質(zhì)結構的形成、基因表達調(diào)節(jié)以及生長控制。大量研究證據(jù)支持EZH2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［10－12］。目前已在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EZH2表達增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并發(fā)現(xiàn)EZH2高表達與腫瘤的進展和預后差相關。體外研究亦支持EZH2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［13－15］。

Chromobox 7（CBX7）蛋白是Poly Colnb家族一員；Polycomb group（PcG）蛋白家族是基因調(diào)控決定細胞命運的組成部分，它被認為能通過下調(diào)INK4a／ARF腫瘤抑制因子的表達控制細胞增殖，它的紊亂能夠導致腫瘤發(fā)生［16－17］。CBX7（ehromobox homolog 7）主要分布于染色質(zhì)、核，其分子功能通過與染色質(zhì)結合實現(xiàn)。目前已有研究表明CBX7在腫瘤細胞中有表達，但不同腫瘤中CBX7表達情況與腫瘤的惡性程度的關系有不同表現(xiàn)，部分腫瘤CBX7高表達提示腫瘤惡性程度高，在另外的腫瘤則相反［18－20］。

實驗采用免疫組織化學方法對EZH2和CBX7在50例人皮膚血管瘤組織中的表達進行了檢測。本實驗結果顯示：在增生期血管瘤內(nèi)皮細胞中EZH2的含量明顯高于退化期和正常皮膚組織 （P＜0.05），這提示了EZH2作為一個新的癌基因，在血管瘤的增殖期高表達，表現(xiàn)為刺激血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤形成。這一過程分別受到腫瘤細胞轉移促進相關基因和轉移抑制相關基因的調(diào)控。而CBX7在增生期血管瘤內(nèi)皮細胞中也呈高表達，提示CBX7與腫瘤細胞的異常增殖密切相關，推測其可能成為預測腫瘤預后的分子標記物和潛在治療靶點。我們并且分析EZH2和CBX7在增生期血管瘤組織中都呈高表達，兩者關系密切，在EZH2蛋白高表達的組織中CBX7組織也呈高表達。提示EZH2和CBX7可能共同促進血管瘤的發(fā)生和發(fā)展。

［1］Smolinski KN，Yan AC.Hemangiomas of infancy：clinical and biological characteristics.Clin Pediatr，2005，44（5）：747－766

［2］Shan S，Shan G，Zhang D.Treatment of hemangioma by transfection of antisense VEGF gene.J Huazhong Univ Sci Technolog，2009，29（3）：335－339

［3］Bauland C G，van Steensel M A，Steijlen P M，et al.The pathogenesis of hemangiomas：a review.Plast Reconstr Surg，2006，117：29e－35e

［4］Xu K，Wu ZJ，Groner AC，et al.EZH2 oncogenic activity in castration－resistant prostate cancer cells is Polycomb－independent.Science，2012，338（6113）：1465－1469

［5］Cavalli G.Molecular biology.EZH2 goes solo.Science，2012，338（6113）：1430－1431

［6］Forzati F，F(xiàn)ederico A，Pallante P，et al.Tumor suppressor activity of CBX7 in lung carcinogenesis.Cell Cycle，2012，11（10）：1888－1891

［7］RA Schwartz，MI Sidor，ML Musumeci，et al.Infantile hemangiomas：a challenge in paediatric dermatology.JEADV，2010，24：631－638

［8］Haggstrom A N，Drolet B A，Baselga E，et al.Prospective study ofinfantile hemangiomas：clinical characteristics predicting complications and treatment.Pediatrics，2006，118：882－887

［9］Guang SHAN，Tian TANG，Duanlian ZHANG，et al.Expression of HLA－G in Hemangioma and Its Clinical Significance.J Huazhong Univ Sci Technol，2012，32（5）：645－648

［10］Kheradmand Kia S，Solamiani Kartalaei P，F(xiàn)arahbakhshian E，et al.EZH2－dependentchromatin looping controls INK4a and INK4b，butnot ARF，during human progenitor celldifferentiation and cellular senescence.Epigenetics Chromatin，2009，2（1）：16－19

［11］Woodhouse S，Pugazhendhi D，Brien P，et al.EZH2 maintains a key phase of muscle satellite cell expansion but does not regulate terminal differentiation.Mol Cell，2012，48（4）：487－488

［12］Chen YH，Hung MC，Li LY.et al.EZH2：a pivotal regulator in controlling cell differentiation.Am J Transl Res，2012，4（4）：364－375

［13］Lee HW，Choe M.Expression of EZH2 in renal cell carcinoma as a novel prognostic marker.Pathol Int，2012，62（11）：735－741

［14］Holm K，Grabau D，Lvgren K，et al.Global H3K27 trimethylation and EZH2 abundance in breast tumor subtypes.Mol Oncol，2012，6（5）：494－506

［15］Lasfargues C，Pyronnet S.EZH2 links pancreatitis to tissue regeneration and pancreatic cancer.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36（4）：323－324

［16］Gao Z，Zhang J，Bonasio R，et al.PCGF homologs，CBX proteins，and RYBP define functionally distinct PRC1 family complexes.Mol Cell，2012，45（3）：344－356

［17］Forzati F，F(xiàn)ederico A，Pallante P，et al.CBX7 is a tumor suppressor in mice and humans.J Clin Invest，2012，122（2）：612－623

［18］Guan ZP，Gu LK，Xing BC，et al.Downregulation of chromobox protein homolog 7 expression in multiple human cancer tissues Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi，2011，45（7）：597－600

［19］Pallante P，Terracciano L，Carafa V，et al.The loss of the CBX7 gene expression represents an adverse prognostic marker for survival of colon carcinoma patients.Eur J Cancer，2010，46（12）：2304－2313

［20］Karamitopoulou E，Pallante P，Zlobec I，et al.Loss of the CBX7 protein expression correlates with a more aggressive phenotype in pancreatic cancer.Eur J Cancer，2010，46（8）：1438－1444

圖 版 說 明

圖1 增生期血管瘤EZH2的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），EZH2表達強，S－P×200

圖2 退化期血管瘤EZH2的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），EZH2表達弱，S－P×200

圖3 正常皮膚組織EZH2的表達 正常皮膚組織血管內(nèi)皮細胞核或胞質(zhì)內(nèi)有少量的棕黃色顆粒（→），EZH2表達弱，S－P×200

圖4 增生期血管瘤CBX7的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），CBX7表達強，S－P×200

圖5 退化期血管瘤CBX7的表達 血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達弱或無表達（→），S－P×200

圖6 正常皮膚組織CBX7的表達 正常皮膚組織血管內(nèi)皮細胞核或胞質(zhì)內(nèi)有少量的棕黃色顆粒（→），CBX7表達弱，S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 EZH2 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of pro－liferating endothelial cells，EZH2 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.2 EZH2 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.3 EZH2 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.4 CBX7 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，CBX7 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.5 CBX7 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.6 CBX7 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200