廖 婷 ，袁德義 ，彭邵鋒 ，鄒 鋒

油茶自交和異交過(guò)程花粉管生長(zhǎng)的熒光顯微觀察

廖 婷1，袁德義1，彭邵鋒2，鄒 鋒1

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

以普通油茶‘華碩’為試材，運(yùn)用熒光顯微觀察法，研究了其自交和異交授粉后花粉在花柱上萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)變化情況。結(jié)果表明：自交和異交授粉后，花粉均能在柱頭上正常萌發(fā)，且花粉管均能生長(zhǎng)到花柱基部，但生長(zhǎng)速度不一樣，異交的生長(zhǎng)速度略快于自交；自交授粉72 h后花粉管到達(dá)花柱基部，異交60 h到達(dá)花柱基部，自交192 h后花粉管到達(dá)胚囊；自交與異交授粉花粉管白天生長(zhǎng)速度均顯著高于晚上。

油茶；自交；異交；花粉管；顯微觀察

油茶Camellia oleifera 屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia 植物，為常綠小喬木或灌木，是我國(guó)南方重要的木本食用油料樹(shù)種[1]。油茶在我國(guó)已有2 000多年的栽培歷史，主要分布在長(zhǎng)江流域及其以南的14個(gè)省（市、區(qū)），現(xiàn)有油茶面積約300 hm2，年產(chǎn)值近200億元，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)中占著十分重要的地位[2]。茶油色清味香，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)保健食用油，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，被譽(yù)為“東方橄欖油”[3]。

近年來(lái)，關(guān)于油茶的研究主要集中在育苗[4-5]、土肥水管理[6-7]、病蟲(chóng)害防治以及良種選育等領(lǐng)域上，盡管在栽培技術(shù)上取得了一定的成果，然而油茶在實(shí)際生產(chǎn)中存在授粉受精不良的現(xiàn)象，表現(xiàn)為授粉后花粉管不能萌發(fā)和生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致油茶“座果率低、結(jié)實(shí)率低”的問(wèn)題。對(duì)此，不少研究者從油茶花粉特性出發(fā)，對(duì)其花粉數(shù)量[8-9]、花粉形態(tài)特征[10-11]、花粉離體萌發(fā)[12]與貯藏[13-15]進(jìn)行了大量研究，卻還不夠系統(tǒng)。油茶正常授粉后花粉在柱頭上萌發(fā)及花粉管在花柱、子房中生長(zhǎng)的行為，是油茶受精座果的前提，并直接關(guān)系到油茶能否結(jié)實(shí)。所以，開(kāi)展油茶自交和異交授粉后花粉管生長(zhǎng)行為的研究，這對(duì)生產(chǎn)上進(jìn)行油茶合理品種配置、提高其座果率和結(jié)實(shí)率等具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

目前，有關(guān)山茶屬自花和異花授粉后花粉管生長(zhǎng)行為有一些報(bào)道，如梁漢興等[16]觀察了金花茶花粉粒在野山茶柱頭上生長(zhǎng)的行為，96 h到達(dá)其花柱的3/4處，120 h進(jìn)入子房；楊志玲等[17]以長(zhǎng)瓣短柱茶、浙江紅山茶為試材，研究了花粉管在柱頭及花柱中行為，發(fā)現(xiàn)花粉管在2/3花柱時(shí)伸長(zhǎng)速度慢并形成胼胝質(zhì)；王郁等[18]觀察到茶樹(shù)品種龍井43自交花粉可以在柱頭上正常萌發(fā)并生長(zhǎng)，授粉24 h內(nèi)自交與異交花粉管生長(zhǎng)特性無(wú)明顯差異，而授粉后24 h自交花粉管生長(zhǎng)速度明顯慢于異交。然而，關(guān)于油茶的自交和異交花粉管生長(zhǎng)行為研究的相關(guān)報(bào)道較少[11,19-20]。因此，本試驗(yàn)以大果油茶良種‘華碩’[21]為試材，從形態(tài)學(xué)的角度對(duì)其自交和異交花粉管的生長(zhǎng)行為進(jìn)行了熒光顯微觀察，以此了解‘華碩’自花和異花授粉時(shí)花粉管在花柱中的行為及其胼胝質(zhì)發(fā)生的位置，為今后油茶良種合理配置、高效栽培及雜交育種提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料均來(lái)自中南林業(yè)科技大學(xué)馬家河試驗(yàn)基地油茶種質(zhì)資源收集圃?；匚挥诒本?8°06′03″，東經(jīng)111°56′30″，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，四季分明，雨水充沛，日照充足，平均氣溫16～18℃，年平均降水量1 200 mm，平均日照1 600 h，無(wú)霜期285 d，為油茶的最適生長(zhǎng)區(qū)域之一。供試材料為普通油茶‘華碩’（ 2009年通過(guò)國(guó)家林木品種審定），授粉品種為‘華鑫’（2009年通過(guò)國(guó)家林木品種審定），樹(shù)齡30 a，樹(shù)勢(shì)中等，均能正常開(kāi)花結(jié)果。試驗(yàn)地水肥條件良好，立地條件和管理措施完全一致。

1.2 方 法

1.2.1 花粉的采集

花粉采集按袁德義等[13]的方法，取大蕾期的花朵室內(nèi)催花，花粉貯藏于貼有標(biāo)簽的小瓶中備用。

1.2.2 熒光顯微觀察法

在2010年11月上旬‘華碩’、‘華鑫’盛花期進(jìn)行人工控制授粉，分別采集自花（‘華碩’ב華碩’）和異花（‘華碩’ב華鑫’）授粉后1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、144、168、192 h的雌蕊各10個(gè)（花柱和子房），用卡諾氏固定液（乙醇∶醋酸=3∶1）固定12 h后轉(zhuǎn)入70﹪乙醇中低溫保存?zhèn)溆?。參照鄒鋒[20]的方法稍作修改，用8 mol/L NaOH軟化4～5 h，蒸餾水沖洗后，在0.05﹪苯胺藍(lán)溶液(0.05﹪苯胺藍(lán)+0.15 mol磷酸氫二鉀)中染色4 h，材料常規(guī)壓片。在Olympus BX-51型熒光顯微鏡下觀察，分別觀測(cè)柱頭上花粉的萌發(fā)和花粉管在花柱內(nèi)的生長(zhǎng)情況，并數(shù)碼拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用數(shù)碼測(cè)距軟件Digimizer Image Analysis V3.1.1.0測(cè)量花粉管在花柱中生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，并用Office Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自交花粉管的行為

授粉的花柱經(jīng)染色后，‘華碩’花粉粒和花粉管在綠色熒光的激發(fā)下呈現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)綠色熒光，可以觀察到其花粉粒在柱頭上萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)情況。自花授粉后1 h，柱頭上沒(méi)有花粉萌發(fā)；授粉后2 h，柱頭上有部分花粉粒開(kāi)始萌發(fā)，少數(shù)花粉管通過(guò)乳突細(xì)胞伸入柱頭（圖1，a）；授粉后24 h，大量花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)至花柱1/3處（圖1，b）；授粉后48 h，花粉管達(dá)花柱中部，沿花柱道向下生長(zhǎng)（圖1，c）；授粉后60 h，花粉管長(zhǎng)至花柱中下部；授粉后72 h，有部分花粉管開(kāi)始到達(dá)花柱基部（圖1，d）；授粉后84 h，大量花粉管到達(dá)花柱基部（圖1，e）；授粉后96 h，可見(jiàn)花粉管開(kāi)始穿過(guò)花柱基部（圖1，f）；授粉后120 h，花粉管在花柱基部和子房相連的組織中生長(zhǎng)，到達(dá)子房上端（圖1，g）；授粉后192 h，花粉管到達(dá)胚囊（圖1，h）。

圖1 ‘華碩’自交花粉管的生長(zhǎng)情況Fig. 1 Pollen tube growth of self-pollination in ‘Huashuo’

2.2 異交花粉管的行為

在異花授粉過(guò)程中，授粉后2 h，可見(jiàn)‘華碩’柱頭上部分‘華鑫’花粉粒萌發(fā)（圖2，a）；授粉后24 h，大量‘華鑫’花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)至‘華碩’花柱1/3處（圖2，b），與自交情況無(wú)明顯差異；授粉后36 h，花粉管已達(dá)其花柱中部（圖2，c）；授粉后48 h，花粉管長(zhǎng)至其花柱中下部；授粉后60 h，可見(jiàn)部分花粉管開(kāi)始到達(dá)花柱基部（圖2，d）；授粉后84 h，花粉管開(kāi)始穿過(guò)花柱基部（圖2，e）；授粉后96 h，可見(jiàn)大量‘華鑫’花粉管穿過(guò)‘華碩’花柱基部（圖2，f）。

圖2 ‘華碩’異交花粉管的生長(zhǎng)情況Fig. 2 Pollen tube growth of cross-pollination in ‘Huashuo’

2.3 自交與異交花粉管生長(zhǎng)情況比較

自交和異交花粉管生長(zhǎng)情況的比較見(jiàn)圖3。由圖3可知：‘華碩’自交和異交花粉管的生長(zhǎng)速度不同，異交授粉生長(zhǎng)速度比自交快。在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，自交花粉管于授粉后72 h生長(zhǎng)至花柱基部，而異交花粉管則在授粉后60 h到達(dá)花柱基部。

圖3 自交與異交花粉管生長(zhǎng)情況的比較Fig.3 Comparison of pollen tubes growth in self-pollination and cross pollination

‘華碩’自交和異交花粉管各時(shí)間段平均生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖4。由圖4可知，‘華碩’自交和異交花粉管不同時(shí)間段的平均生長(zhǎng)速度具有較明顯的差異，且各時(shí)間段異花的花粉管均比自花花粉管生長(zhǎng)速度快。授粉后0～2 h和2～8 h，自交和異交授粉花粉管均比其他時(shí)間段生長(zhǎng)迅速，自交平均生長(zhǎng)速度分別為 37.688 μm/h 和 44.735 μm/h，異交分別為43.174 μm/h 和 48.148 μm/h；授粉后 24 ～ 36 h 和48～60 h，花粉管生長(zhǎng)相對(duì)較快；授粉后12～24 h和36～48 h，花粉管生長(zhǎng)緩慢，自交授粉花粉管平均生長(zhǎng)速度分別為9.343 μm/h和11.591 μm/h，異交分別為9.041 μm/h和19.841 μm/h。通過(guò)分析可知，整個(gè)過(guò)程中，自交授粉的平均生長(zhǎng)速度為22.507 μm/h，異交授粉的平均生長(zhǎng)速度為26.504 μm/h，兩者速度相差不大。但是油茶‘華碩’自交授粉花粉管白天生長(zhǎng)速度為 30.73 μm/h，晚上僅為 14.283 μm/h，白天速度為夜晚的2.15倍；異交授粉花粉管白天生長(zhǎng)速度為 34.546 μm/h，晚上為 14.441 μm/h，白天速度為晚上速度的2.39倍。

圖4 自交與異交花粉管各時(shí)間段平均生長(zhǎng)速度的比較Fig.4 Comparison of average growth speed of self-pollination and cross pollination pollen tubes among each time periods

3 結(jié)論與討論

內(nèi)外因子對(duì)普通油茶‘華碩’花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)油茶‘華碩’花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的觀察表明，其自交和異交授粉花粉管均能生長(zhǎng)到花柱基部，但生長(zhǎng)速度不一樣，異交的平均生長(zhǎng)速度（26.504 μm/h）大于自交（22.507 μm/h），并且自交授粉72 h后花粉管到達(dá)花柱基部，異交60 h到達(dá)花柱基部。這與何春燕[19]對(duì)油茶‘湘林1號(hào)’、鄒鋒[20]對(duì)攸縣油茶、李春林等[11]對(duì)油茶‘長(zhǎng)林4號(hào)’授粉后花粉管生長(zhǎng)速度和時(shí)間范圍的結(jié)果不一，產(chǎn)生這種差異的可能原因與物種遺傳特性、自身營(yíng)養(yǎng)條件狀況等有著密切的關(guān)系[22]。隨著授粉后時(shí)間推移，油茶‘華碩’自交與異交花粉管的生長(zhǎng)速度總體上來(lái)說(shuō)呈下降趨勢(shì)，前期生長(zhǎng)快，后期生長(zhǎng)慢，且花粉管數(shù)量逐漸減少，這種現(xiàn)象與Suwan等[23]提出的“二核花粉管生長(zhǎng)分為自養(yǎng)階段和異養(yǎng)階段，在自養(yǎng)和異養(yǎng)階段，花粉管生長(zhǎng)較快，而在它們的過(guò)渡階段花粉管生長(zhǎng)較慢”相一致，但是有關(guān)決定油茶花粉管生長(zhǎng)速度的因子，如鈣與鈣調(diào)素等對(duì)花粉管有定向生長(zhǎng)的調(diào)控作用，這還需要進(jìn)一步研究。

外因主要是花期氣候環(huán)境條件影響花粉萌發(fā)[24]和花粉管生長(zhǎng)行為[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘華碩’自花和異花授粉的花粉管白天的平均生長(zhǎng)速度均比夜晚的生長(zhǎng)速度快，可能原因是‘華碩’秋冬季節(jié)開(kāi)花，且實(shí)驗(yàn)基地位于鄉(xiāng)村，夜晚溫度明顯低于白天溫度，所以，花粉管晚上生長(zhǎng)緩慢。這與范學(xué)翠等[26]對(duì)無(wú)籽八月橘的授粉后花粉管行為的研究結(jié)果類似，在陰天無(wú)風(fēng)條件下異花授粉的花粉管生長(zhǎng)速度比在晴天無(wú)風(fēng)條件下自花授粉的速度慢。因此，溫度也是影響油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的重要因子之一。

研究結(jié)果還表明，‘華鑫’花粉管在花柱和子房生長(zhǎng)過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積和胼胝質(zhì)塞出現(xiàn)的情況，由此說(shuō)明‘華鑫’適宜做大果油茶良種‘華碩’的授粉樹(shù)，在生產(chǎn)上應(yīng)配套栽植。

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A fluorescence microscope observation on self and cross-pollination of pollen tubes in Camellia oleifera

LIAO Ting1, YUAN De-yi1, PENG Shao-feng2, ZOU Feng1
(1.Key Lab. of Non-wood Forest Products of Forestry Ministry , Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry Science, Changsha 410004, Hunan, China)

Germination of pollens and growth of pollen tubes were observed in Camellia oleifera (‘huashuo’) after self and crosspollination by fluorescence microscope observation method. The results show that the pollens in self and cross-pollination germinated normally, and the pollen tubes could reach the style base, while the values of growth speed were different. The growth speed in crosspollination was slightly faster than that in self-pollination. The pollen tubes arrived at the style base in 72 hours after self-pollination,while it took 60 hours dealing with cross-pollination, and the pollen tubes entering into the embryo sac 192 hours after self-pollination;the study also revealed that the growth speed during the daytime was significantly higher than at nighttime between in the self-pollination and the cross-pollination pollen tubes.

Camellia oleifera; self-pollination; cross-pollination; pollen tubes；microscope observation

S794.4

A

1673-923X (2012)07-0034-04

2012-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“油茶自交敗育機(jī)制研究”（31170639）

廖 婷（1989—），女，江西萍鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)林育種栽培研究;E-mail: liaoting19@163.com

袁德義（1967—），男，湖北隨州人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，長(zhǎng)期從事經(jīng)濟(jì)林栽培及育種研究;

E-mail: yuan-deyi@163.com

[本文編校：謝榮秀]