李光友，徐建民，吳世軍，杜志鵠，韓 超，王 偉，陸釗華，李寶琦

(中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

尾葉桉雜種子代DNA提取和SSR引物篩選

李光友，徐建民，吳世軍，杜志鵠，韓 超，王 偉，陸釗華，李寶琦

(中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

以SSR分子標記法分析尾葉桉(Eucalyptus urophylla)及其雜種間關系，采用改良CTAB法提取總DNA，同時優(yōu)化提取方法和PCR擴增條件。從文獻中選取尾葉桉100對SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的17對引物作為實驗尾葉桉雜種材料的SSR分析引物，為進一步對其進行遺傳多樣性和有效基因資源利用研究奠定基礎和提供依據(jù)。

尾葉桉家系；DNA提??；SSR引物篩選

桉樹系統(tǒng)引種和栽培在中國已開展20年多年，通過尾葉桉等的引種，在桉樹遺傳改良、資源保存及推廣應用上取得重大進展[1]。尾葉桉具有速生、適應性廣及多種用途的特點，通過引入其它具有速生、耐寒、耐旱、抗逆性強的優(yōu)良桉樹花粉，利用控制授粉技術獲得更加優(yōu)良的雜種子代。只有通過優(yōu)樹及其雜種子代的基礎研究才會使尾葉桉雜種人工林獲得更大發(fā)展，滿足社會對于木材的巨大需求，以期獲得更大的經(jīng)濟效益和社會效益。分子水平的研究，使雜種目的性狀的獲得具有不同于表型選擇的穩(wěn)定性和可靠性。

SSR標記因具有：整個基因組中隨機分布；

多態(tài)性高；重復性好；技術難度低；引物序列公開發(fā)表等特點[2]，而在動植物的遺傳分析[3-5]中得到了廣泛應用，隨后林學專家開展了該標記在林木研究中的利用[6-7]。SSR的共顯性標記適用于QTL定位研究，便于對有關QTL的遺傳動態(tài)跟蹤，增強對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力，提高育種中數(shù)量性狀位點判讀的準確性以加速利用。在育種工作中，SSR技術與現(xiàn)有育種程序相結合，為尾葉桉的分子輔助選擇和遺傳改良提供了科學依據(jù)，促進目的基因的定位和選擇、為其有效利用提供技術和材料保證，從而加快育種進程。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用尾葉桉家系來自課題早期引種種子園。具體參試種源及家系來源見表1。不同家系隨機取樣，不同個體分別登記，共151株。每株取其幼嫩葉片，擦拭干凈低溫保存。注入與未注入家系間關系及研究方法參見文獻[8]。

表1 參試桉樹種批原產(chǎn)地及家系編號Table 1 Seeds sources of seed-lots and numbers of families used in the trial

PCR過程中用于實驗篩選的100引物引自文獻[9]，由上海生工生物技術有限公司合成，同時實驗用Taq酶、dNTPs、Loading buffer及 Maker等均購自該公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和濃度確定[10-11]

采用改進CTAB法提取的桉樹進行DNA提取。取適量葉碎樣于2 mL磨樣管中，加入鋼珠；在球磨儀上磨3.5 min，24次/秒，P1模式；加入1 mL CTAB液(含2%B-巰基乙醇)，65 ℃水浴45 min，需數(shù)分鐘1次震蕩；離心10 min，12 000 r·min-1；取上清于1 mL新管中，200 μL槍頭，然后各管中加入等體積氯仿-異戊醇液(24∶1, v/v)；離心10 min，取上清于新管中，加入550 μL氯仿-異戊醇液；離心10分鐘，再取上清于新管中，加入4 ℃異丙醇約400 μL沉淀；－20 ℃冰箱冰凍10 h以上；取出解凍，離心10 min，倒上清，吸干；加入75%酒精1 mL洗滌洗3次，然后吸干；重復本步驟；45 ℃下干燥機內(nèi)干燥5 min；加入1×TE150 μL，離心10 min，將上清移至新管中，管中液體即為含有DNA的樣品；

提取后對DNA濃度檢測。每樣品取2 μL加4 μL Loading buffer，移液槍混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳。以100 bp plus的DNA Ladder標定，初步判定2 μL樣中所含DNA量，然后根據(jù)檢測濃度將提取各DNA樣稀釋成相同的實驗濃度，供PCR擴增時采用。

1.2.2 引物篩選[12]具體步驟：

(1) 以2個母本DNA進行條件優(yōu)化(采用第6對引物來進行，98 bp)進行32次初篩；(2) 在初篩獲得的優(yōu)化條件，以該2母本及其子代進行復篩，各進行多次重復實驗，選擇擴增效果好的引物。最終從尾葉桉100對SSR引物中篩選出適合本批次樣品的17對引物用于全部樣品擴增和SSR分析(見表2)。

表2 尾葉桉SSR分子標記用引物序列及退火溫度Table 2 The primer sequence and annealing temperature for SSR of Eucalyptus urophylla

1.2.3 PCR擴 增PCR擴 增 反 應 在AB 2720 Thermal Cycler上完成。

對Mg2+、Taq酶、dNTPs及模板濃度條件的多次優(yōu)化和篩選，同時每次PCR做一個負對照來檢測試劑是否污染。反應在滅菌的0.2 mL薄壁離心管中和PCR擴增儀上進行。反應體系采用10 μL反應體系，即10 × buf fer1.0 μL、25 mM MgCl20.6 μL、l0 mM dNTPs 0.30 μL、Primer 0.4 μL、5UTaq DNA聚合酶0.1 μL和2.0 μL DNA模板4 ng，最終加ddH2O至Total10 μL。樣品94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃條件下保存擴增樣品。反應步驟：

1)tt冰浴中每反應管中加人2.0 u1DNA模板；

2)按以上建立反應體系取反應物依次裝入1滅菌1.5 mL離心管中，渦旋2～3 s；

3)取上述混合物10.0 μL，分別加人0.2 mL反應管中，使每管的總反應體積為10.0 μL；

4)將裝有反應液的離心管在臺式渦旋機上渦旋 2～3 s；

5)混勻好的離心管放人臺式離心機內(nèi)離心5～6 s，取出后離心管蓋蓋；

6)離心管置于PCR儀上擴增，結束后，樣品管4 ℃冰箱保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

PCR反應結束后，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR結果檢測。

1)配制足夠量的電泳緩沖液(0.5×TBE)，倒入電泳槽中備用；現(xiàn)配1.2%的瓊脂糖凝膠；

2)凝膠稍涼后加入鼎國生物GoldviewTM牌Nucleic Acid Stain染料(5 μL/100 mL)，輕輕搖勻；

3)將制膠模具置于水平板上，調(diào)水平，兩端用封口膠封?。?/p>

4)常溫下置膠于60 ℃時，倒入模具內(nèi)，約3～5 mm厚，然后迅速在模具一端安插上梳子；

5)室溫冷卻待瓊脂糖凝膠全部凝固，輕拔出梳子，并移去擋板；

6) 用移液槍混勻樣品，點樣品于凝膠孔內(nèi)(每孔含擴增樣2 μL和4 μL溴酚藍)，樣品按順序點入，同時點入北京鼎國生產(chǎn)的DGL 2000 DNA Marker(100～2000 bP )用于比對；

7)將有樣品的一端置于電泳槽負極端，電泳液沒過瓊脂糖凝膠l mm左右，電泳電壓為105 V；

8)電泳結束后，將凝膠平鋪在凝膠成像儀內(nèi)，打開紫外燈，檢測擴增結果并記錄。

1.2.5 銀染法檢測擴增結果的程序

1)對瓊脂糖凝膠電泳檢測能獲得引物專一和擴增清晰的樣品，進行銀染法檢測；

2)PAGE膠的制備

玻璃板的清洗。用水洗凈，垂直晾干；水平放置玻璃板+無水乙醇擦1次；凹板玻璃用剝離硅烷清洗、紙巾涂勻，4～5 min后95%乙醇擦2～3次；平板玻璃以2.0 mL乙醇+50 μL親合硅烷涂勻，3～5 min后紙吸去多余親合硅烷。后組裝玻璃面加上側(cè)邊密封條并灌膠；

灌膠。90 mL6%的變性聚丙烯酰胺中加入TEMED30 μL、10%過硫酸銨(0.1 g溶于水，現(xiàn)配)800 μL，在平穩(wěn)玻璃面上勻速傾倒膠，同時扶住凹板玻璃往上扣下，勻速無泡且防膠漏，待膠流動均勻布滿玻璃面后，夾好兩塊吻合玻璃，在灌膠口倒插入梳子，聚合5 min至膠凝固，后取出梳子，再正向插入梳齒，形成各樣孔間密封的點樣孔；

3)電泳

灌裝1×TBE電泳液于上下槽中，豎膠版于電泳槽內(nèi)。70 W恒功率預電泳15 min。斷電條件下點樣，點樣時的Maker為Bio BASIC Inc.生產(chǎn)的 GM345 DNA Marker (50～1000 bP 1adder-H2)。

每樣孔加6 μL預變性的PCR擴增混合樣品(擴增產(chǎn)物與指示劑按10：3，指示劑為甲酰胺+溴酚蘭)，70 W恒功率電泳90 min(50～300 bp擴增產(chǎn)物)，電泳結束后，用刀片分開兩塊玻璃板，膠會緊貼在涂有binding Silane 的平板玻璃上。

4)銀染

過程：銀染(膠板置入染色液中，輕輕搖動并淹沒板面10～15 min)-沖洗(用2 000 ml去離子水沖洗膠板3～5 min)-顯影(膠板快速轉(zhuǎn)移到1 600 mL顯影液中并輕輕搖動，直到譜帶出現(xiàn))-沖洗(用去離子水或自來水沖洗3～4 min，洗掉其上的堿性物質(zhì))-干燥：室溫下晾干，長期保存。

5)判讀，分析

采用上海小源科技有限公司小源凝膠圖像分析系統(tǒng)對所拍圖片判讀或?qū)︺y染片直接判讀統(tǒng)計。運用POPGENE Version 1.32[13]軟件進行不同家系/個體間相互關系的數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法的優(yōu)化

DNA質(zhì)量的好壞直接關系到實驗的成敗。為了得到高質(zhì)量的基因組DNA，試驗中對常規(guī)CTAB法進行改良,增加了2%β-巰基乙醇和DNA材料多次異丙醇沉淀離心、乙醇洗浴和TE溶液溶解的步驟洗去雜質(zhì)，獲得了較高質(zhì)量和濃度的DNA (圖1)，從而滿足實驗所需。

圖1 兩批次各30個個體DNA濃度檢測(M-100bp plus DNA ladder， Lane1-30：樣本DNA)Fig. 1 The total DNA was extracted from 30 samples of Eucalyptus urophylla

從圖1看出，第1批30個樣中，除16號濃度稍低外，其它樣品DNA幾乎均高于標準DNA(M)；第2批樣品中16、22號DNA濃度低于標準濃度。2批次結果表明16號樣品需要重新提取DNA。

2.2 擴增條件的優(yōu)化

通過正交設計和重復試驗，在反應體系中以不同濃度的MgCl2、dNTP、模板DNA配比，并以文獻給定46～64 ℃的退火溫度處理，研究不同因素組合對擴增產(chǎn)物的影響。結果表明在退火溫度給定的情況下擴增關鍵在于Taq酶濃度、引物濃度以及Mg2+濃度，這與王潤輝等[14]對松樹雜種SSR反應條件的優(yōu)化所得結論一致。

2.3 SSR引物的篩選

，獲得本次實驗所需的SSR引物。盡管在PCR過程省去對退火溫度的優(yōu)化，但并非所有現(xiàn)成引物均能擴增產(chǎn)物和產(chǎn)生清晰條帶。另外參試家系通過人工雜交，其子代親緣關系較近，因此具有不同于相同引物對天然群體的擴增效果。因此本研究利用尾葉桉的SSR標記，從100對引物中篩選合適的引物，進行擴增，在淘汰了無擴增帶和擴增后多態(tài)性不理想的引物，選留那些擴增條帶清晰而且有明顯多態(tài)性片段的引物。最終獲得適用于尾葉桉雜種子代研究的17對引物(表2)。

2.4 同一引物不同樣品的擴增效果

對尾葉桉進行了17對引物的擴增和效果檢驗，其中3對引物的結果見圖2。

圖2 3對SSR引物在尾葉桉不同個體中擴增出的多態(tài)圖譜Fig. 2 SSR polymorphism in E. urophylla hybrids with EMBRA23, EMBRA44 and EMBRA59

圖2為3對SSR引物對部分尾葉桉雜種個體的PCR擴增后經(jīng)PAGE膠電泳后的多態(tài)圖譜，不同個體間擴增出差異性條帶，個體間表現(xiàn)出差異和等位基因的分離，多態(tài)性明顯。

3 討 論

在現(xiàn)實遺傳標記技術中，通過建立、篩選基因組文庫，克隆測序、引物設計等一系列實驗，獲得可靠且用于生產(chǎn)實踐的SSR分子標記，需要投入大量人力、物力。隨著參與人員和研究方法的增多、互聯(lián)網(wǎng)資源共享，使更有效、更深入的技術研究獲得成效，實用性和目的性更強，實現(xiàn)著微觀指導宏觀的現(xiàn)實目標。本實驗利用已有文獻中的尾葉桉SSR引物中篩選出適合尾葉桉人工雜種使用的17對引物，實現(xiàn)多態(tài)性和穩(wěn)定性擴增，達到對近親群體的進一步研究和利用。從擴增圖譜上看，引物對部分家系材料進行了擴增，每個樣品基本上都獲得清晰的擴增條帶，多態(tài)位點較多。實驗過程中所選的材料包括了尾葉桉自由或控制授粉全同胞或半同胞家系，具有一定的代表性，建立的尾葉桉人工雜種子代SSR擴增體系，為進一步研究親緣關系較近群體的遺傳多樣性奠定了基礎。目前國內(nèi)對尾葉桉遺傳多樣性、從DNA水平揭示尾葉桉遺傳資源方面的研究文獻[15-16]較少。國外為保障育種項目的長期遺傳增益而進行了尾葉桉育種群體遺傳多樣性研究[17-18]。今后為保障桉樹育種工作的有效和持續(xù)進行，需要利用分子標記對天然雜交種的鑒定，繁育系統(tǒng)的研究，和目的基因定位。本研究也為尾葉桉人工雜種研究提供了SSR分子標記引物。隨著對尾葉桉雜種進一步開發(fā)利用和研究，SSR分子標記將應用于尾葉桉雜種子代優(yōu)良無性系品種鑒定、遺傳分析、遺傳圖譜建立、分類研究、目的基因應用以及種質(zhì)資源鑒定等各個領域。

利用文獻獲得100對尾葉桉SSR分析的引物中，僅17對引物產(chǎn)生較好擴增效果和多態(tài)性擴增產(chǎn)物，可能與入選的人工控制授粉家系各個體間親緣關系較近有關，今后需進一步深入研究。

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DNA extracting and SSR primer screening of Eucalyptus hybrids

LI Guang-you, XU Jian-min, WU Shi-jun, DU Zhi-hu, HAN Chao, WANG Wei, LU Zhao-hua, LI Bao-qi
(Research Institute of Tropical Forestry, CAF, Guangzhou 510520,Guangdong,China)

The total DNA of Eucalyptus urophylla and the hybrids were analyzed using SSR markers. The total DNA was eхtracted by means of improved CTAB isolation method, the eхtraction methods and PCR amplification conditions were optimized. 17 primers were screened from 100 primers which were from a published-article eхisting in Eucalyptus urophylla, which had high polymorphism and stability. The results provide references for genetic diversity research of Eucalyptus urophylla families and single tree using SSR marker.

Eucalyptus urophylla; DNA eхtraction; SSR primer screening

S792.39

A

1673-923X(2012)02-0081-05

2011-09-15

十二五“高產(chǎn)抗逆桉樹”新品種的選育研究（2012BAD01B04-1）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2009KJCX004-02）；廣東省林業(yè)標準化（2009-BS01）；國家科技成果推廣項目“桉樹速生豐產(chǎn)地力維持與可持續(xù)經(jīng)營技術推廣示范”；國家公益行業(yè)專項（201104003）

李光友(1970—)，男，重慶開縣人，副研究員，博士，主要從事熱帶林木遺傳育種研究；E-mail: rwater3000@sohu.com

[本文編校：文鳳鳴]