張海春，李貴興，陳廣東，張 平，范艷云

(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連 116600)

雜交法檢測(cè)重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)發(fā)酵產(chǎn)物HBsAg外源基因拷貝數(shù)

張海春，李貴興，陳廣東，張 平，范艷云

(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連 116600)

以漢遜酵母宿主基因組DNA和發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA的相同MOX啟動(dòng)子的片斷為特異性探針，用地高辛標(biāo)記后，與固定在雜交膜上的宿主基因組DNA和發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA進(jìn)行雜交并顯色，根據(jù)顯色深度來(lái)判定發(fā)酵產(chǎn)物中外源基因拷貝數(shù)的大小。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中HBsAg外源基因拷貝數(shù)不小于30個(gè)。該方法檢測(cè)靈敏度較好，特異性較強(qiáng)，操作較安全，可用于重組漢遜酵母發(fā)酵產(chǎn)物中HBsAg外源基因拷貝數(shù)定性檢測(cè)。

宿主菌基因組DNA;發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA;外源基因拷貝數(shù)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的重組產(chǎn)品投放市場(chǎng)。國(guó)內(nèi)以漢遜酵母作為宿主菌進(jìn)行表達(dá)的重組產(chǎn)品中外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)方法報(bào)道很少，為此有必要建立通過(guò)地高辛標(biāo)記探針來(lái)檢測(cè)重組漢遜酵母外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，以檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性，確保HBsAg在發(fā)酵產(chǎn)物中表達(dá)的水平。

1 材料與方法

1.1 材料

漢遜酵母宿主菌ATCC34438購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心［1］;重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)發(fā)酵產(chǎn)物由大連漢信生物制藥有限公司制備;DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收純化DNA試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Hybond－N(帶正電荷)尼龍膜購(gòu)自英國(guó)Amersham Pharmacia biotech公司;DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche。

1.2 儀器

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600，DZF－3型真空干燥箱(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌/發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA的制備

宿主菌菌體和發(fā)酵產(chǎn)物菌體用酸洗玻璃珠破碎后，通過(guò)DNA提取試劑盒制備。

1.3.2 樣品純度及濃度檢測(cè)［2］

通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法測(cè)定DNA純度和濃度，于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 探針DNA片段的制備

PCR法擴(kuò)增:按順序在200 μL離心管中依次加入10X Taq DNA聚合酶緩沖液5 μL，dNTP液 4 μL，引物1(20 μmol·L－1)1 μL，引物2(20 μmol· L－1)1 μL，宿 主 菌 基 因 組 DNA 模 板1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，補(bǔ)加滅菌注射用水至50 μL，混勻。按下列步驟循環(huán):95℃2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，循環(huán)30次;72℃ 10 min。

瓊脂糖凝膠回收純化DNA試劑盒回收探針DNA片段。

1.3.4 探針DNA標(biāo)記和標(biāo)記率檢測(cè)

探針標(biāo)記:取1 μg探針DNA加滅菌注射用水至15 μL，沸水中煮沸10 min，在冰浴中迅速冷卻 5 min，再加入2 μLhexanucleotide mixture 、2 μL dNTP labeling mixture 、1 μL Klenow enzyme ，混合后短暫離心，于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 h。取出后置65℃水浴中孵育10 min終止反應(yīng)。加入3 mol·L－1乙酸鈉溶液 2 μL，－20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇 80 μL，于 －20 ℃ 作用 2 h，12 000 r·min－1離心15 min，棄上清，加入－20℃預(yù)冷的75%乙醇溶液100 μL洗滌沉淀一次，棄上清，室溫吹干后加入10 μL TE緩沖液溶解沉淀，即為標(biāo)記的探針DNA。

1.3.5 探針標(biāo)記率檢測(cè)［3］

取DIG－Labeled Control DNA稀釋成1 ng·μL－1，分別依次稀釋至 10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01 pg·μL－1。同時(shí)取標(biāo)記好的探針，按照上述方法依次稀釋，然后分別取各濃度點(diǎn)樣1 μL于尼龍膜上，經(jīng)固定和封閉后，通過(guò)AP緩沖液和NBT/BCIP進(jìn)行顯色反應(yīng)，比較兩者顯色深淺從而確定標(biāo)記探針的濃度。

1.3.6 外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)

將準(zhǔn)備好的發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA樣品與宿主菌基因組DNA樣品、DNA稀釋液置100℃水浴中加熱10 min，迅速冰浴冷卻，以8 000 r·min－1離心5 s，然后點(diǎn)膜，120℃干烤30 min固定，雜交過(guò)夜，之后用AP緩沖液和NBT/BCIP進(jìn)行顯色反應(yīng)，與宿主菌基因組DNA單拷貝數(shù)進(jìn)行比較，根據(jù)顏色深淺判定發(fā)酵產(chǎn)物中HBsAg外源基因拷貝數(shù)的大小。

1.3.7 雜交及顯影

雜交及顯色過(guò)程均按照羅氏地高辛試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行，略有改動(dòng)。

1.3.8 重現(xiàn)性

按照上述檢測(cè)方法，對(duì)2批發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行2次測(cè)定，比較2次結(jié)果，考察該檢測(cè)方法的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 宿主菌和發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA［4］

部分從菌體中提取出的宿主菌基因組DNA和發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA電泳圖，如圖1和圖2。結(jié)果表明，制備的基因組 DNA無(wú)RNA存在。A260/A280比值為 1.80 和 1.82，純度符合要求。

圖1 宿主菌基因組DNA電泳圖

圖2 發(fā)酵產(chǎn)物基因組DNA電泳圖

2.2 探針標(biāo)記效率的檢測(cè)

探針標(biāo)記效率的檢測(cè)結(jié)果如圖3。標(biāo)記探針0.1pg稀釋點(diǎn)可見(jiàn)顯色，表明標(biāo)記探針達(dá)到預(yù)期的標(biāo)記效率，而且效率較高。經(jīng)比較兩者顯色深淺，表明標(biāo)記達(dá)到了要求的量，確定探針濃度為100 ng·μL－1。

圖3 探針標(biāo)記效率檢測(cè)圖(陽(yáng)性對(duì)照)

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)

對(duì)2批發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了HBsAg外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)，如圖4。

圖4 重組漢遜酵母發(fā)酵產(chǎn)物外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)圖

由圖4可看出，發(fā)酵產(chǎn)物DNA的30倍稀釋顯色深度不小于宿主菌基因組DNA的顯色深度，說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)物HBsAg外源基因拷貝數(shù)不小于30個(gè)。

2.4 討論

通過(guò)采用地高辛標(biāo)記探針的雜交法，對(duì)重組漢遜酵母發(fā)酵產(chǎn)物中外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果證明該方法具有較好的靈敏度和特異性，可以用于重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制，從而保證其穩(wěn)定性，也可以為其他重組漢遜酵母生物制品中外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)提供參考。提取DNA的菌體材料最好是新鮮培養(yǎng)的菌體，這樣易于DNA的提取，同時(shí)提取的DNA不應(yīng)被RNA或蛋白污染，否則將會(huì)影響到紫外定量的準(zhǔn)確性。使用DNA回收試劑盒進(jìn)行探針用DNA的回收，最好做進(jìn)一步的純化，否則回收產(chǎn)物中會(huì)攜帶一定量的凝膠小顆粒，這些小顆粒會(huì)吸附探針并且會(huì)結(jié)合到膜上，影響雜交結(jié)果的觀察。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)成功建立了外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)方法。此實(shí)驗(yàn)所涉及的操作方法難度小，檢測(cè)成本相對(duì)較低，但操作周期較長(zhǎng)，中間環(huán)節(jié)繁瑣，結(jié)果受干擾的因素較多。相信隨著生物技術(shù)的發(fā)展，此方法會(huì)得到進(jìn)一步的改進(jìn)，同時(shí)應(yīng)加快新方法的探索。

［1］蘇彩霞，張萍，顧美榮，等.重組HBsAg在漢遜酵母中的分泌表達(dá)［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009，22(2):158－161.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］周長(zhǎng)發(fā)，張銳，張曉，等.地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記探針的southern雜交技術(shù)優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2009，11(4):123 －128.

［4］劉君，張振龍.地高辛標(biāo)記探針檢測(cè)重組人干擾素β1b中DNA殘留量［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2007，35(2):19－21.

Hybridization Detection of Copy Number of HBsAg Foreign Gene in Fermentation Products of Recombinant Hepatitis B(Hansenula)

ZHANG Hai－chun，LI Gui－xing，CHEN Guang－dong，ZHANG Ping，F(xiàn)AN Yan－yun
(Department of R＆D，Dalian Hissen Bio－Pharmaceutical INC，Dalian Liaoning 116600，China)

The same MOX promoter fragments of Hansenula yeast host genomic DNA and fermentation products genomic DNA are taken as specific probes.Then the specific probes with digoxigenin labeled are hybridized and been color with host genome DNA fixed in the hybrid membrane and fermentation products genome DNA.The copy number size of foreign gene in fermentation product according to the color depth can be determined.The results show that the copy number of HBsAg foreign gene in fermentation product is not less than 30.The method has such advantages as better detecting sensitivity，stronger specificity and good safety.Therefore，it can be used in qualitative detection of copy number size of HBsAg foreign gene in fermentation product of recombinant Hansenula yeast.

host genomic DNA;fermentation products genomic DNA;foreign gene copy number

O621.14

A

1009－315X(2012)01－00012－03

2011－07－17;最后

2011－09－13

張海春(1978－)，女，滿族，河北秦皇島人，主要從事重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)工藝質(zhì)量控制研究。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)