王 偉, 徐建民，李光友，韓 超，吳世軍，陸釗華

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

24個(gè)桉樹品系遭受桉樹枝癭姬小蜂危害后防御酶活性變化

王 偉, 徐建民，李光友，韓 超，吳世軍，陸釗華

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

選取對(duì)桉樹枝癭姬小蜂不同抗性的24個(gè)桉樹品系，對(duì)其遭受危害過程中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：受害前，桉樹葉片內(nèi)SOD活性、POD活性和PPO活性均表現(xiàn)為高抗品系＞中抗品系＞高感品系；在遭受桉樹枝癭姬小蜂危害后，葉片內(nèi)SOD活性和PPO活性表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)；升高增量排名前三的品系是：檸檬桉、粗皮桉和Et12；活性下降排名前三的是Et09、DH32-29和KX12；POD活性表現(xiàn)為持續(xù)升高并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，升高增量排名前三的是A107、T121和DH42-6；方差分析表明：桉樹葉片內(nèi)防御酶活性的變化在不同抗性品系間差異顯著，表現(xiàn)為高抗品系＞中抗品系＞高感品系。

桉樹品系；桉樹枝癭姬小蜂；超氧化物歧化酶；過氧化物酶；多酚氧化酶

桉樹枝癭姬小蜂Leptocybe invasa Fisher& La Salle屬膜翅目Hymenoptera姬小蜂科Eulophidae,是嚴(yán)重危害桉樹一些品種的枝癭性害蟲。2000年首次發(fā)現(xiàn)與中東及地中海沿岸國(guó)家，2007年在我國(guó)廣西壯族自治區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)[1-3]。該蟲在桉樹的嫩枝、嫩莖、葉柄及葉脈上產(chǎn)卵，形成蟲癭，導(dǎo)致植株枝葉變形、矮化、呈叢枝狀，嚴(yán)重影響桉樹生長(zhǎng)[4]。

目前，對(duì)于桉樹枝癭姬小蜂的化學(xué)防治效果不理想，應(yīng)用抗蟲品種是該病最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，植物在被植食性害蟲取食后，會(huì)發(fā)生一些主動(dòng)反應(yīng)，包括細(xì)胞過敏性壞死、植保素、酚類、醌類物質(zhì)等次生產(chǎn)物的合成、寄主細(xì)胞壁的加強(qiáng)和修飾等[6-7]。植物的這種主動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)與植物體內(nèi)的多種酶的活性密切相關(guān)。其次，植物在遭受害蟲侵害后，常會(huì)引起植物光合速率下降，并且誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御蛋白或防御酶升高[8]，這些防御酶主要包括超氧化物歧化酶（superxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（peroxidase,POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）等。

本實(shí)驗(yàn)選取24個(gè)桉樹品系，在模擬自然狀態(tài)下桉樹枝癭姬小蜂的危害過程，獲得不同品系的抗性能力，在此基礎(chǔ)上通過測(cè)定桉樹葉片內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性變化，了解桉樹受害后的應(yīng)激反應(yīng)，揭示桉樹受害后其植株體內(nèi)防御酶的變化規(guī)律，旨在探討自然狀態(tài)下桉樹應(yīng)對(duì)枝癭姬小蜂的抗性機(jī)制，為后續(xù)開展抗逆新品系選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

表1 參試桉樹品系一覽表Table 1 List of the varieties of Eucalyptus in the trial

1.2 方法

1.2.1 取樣

本實(shí)驗(yàn)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃進(jìn)行，參試品系各30株，移栽于大小為30 cm×20 cm的塑料盆內(nèi)，其中10株作為對(duì)照，用紗網(wǎng)隔離。其余六株，自然環(huán)境下生長(zhǎng)。4月份開始取樣，每個(gè)月上旬取生長(zhǎng)健壯株第3或第4展開葉（自上而下），每株三次重復(fù)，即每株取樣約2 g左右，在植株未發(fā)生死亡等情況下，保持同株取樣，葉片用液氮速凍保存，連續(xù)取樣5個(gè)月。

1.2.2 測(cè)定

超氧化物歧化酶活性的測(cè)定，采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法[9]。過氧化物酶活性的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法[9]。多酚氧化酶活性的測(cè)定 采用三氯乙酸比色法[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行行錄入及核對(duì)，應(yīng)用SAS 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同桉樹品系對(duì)桉樹枝癭姬小蜂的抗性

2011年4月開始每個(gè)月調(diào)查參試品系受桉樹枝癭姬小蜂危害情況。根據(jù)其危害情況，將參試品系分為高抗、中抗和高感3個(gè)類別。24個(gè)參試品系中，尾葉桉3個(gè)品系A(chǔ)107、T121和D48，細(xì)葉桉品系Et16，以及窿緣桉、鄧恩桉、檸檬桉、大花序桉、M1、GL9在調(diào)查的5個(gè)月期間，未受到桉樹枝癭姬小蜂危害，評(píng)定為高抗品系；細(xì)葉桉品系Et12、Et09和巨桉3個(gè)品系KX8、KX3、KX12， 以 及 雷 11、DH19-6、LH1雷 9、DH42-6、DH32-26和DH32-29在桉樹枝癭姬小蜂危害高峰期，出現(xiàn)不同程度危害癥狀，對(duì)桉樹的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響，但均未形成蟲癭，評(píng)定為中抗品系；窿緣桉和DH201在5月份開始進(jìn)入小蜂危害高峰期，植株產(chǎn)生大量的蟲癭，嚴(yán)重阻礙了桉樹的生長(zhǎng)發(fā)育，評(píng)定為高感品系。

2.2 桉樹不同品系葉片內(nèi)過氧化物酶活性的動(dòng)態(tài)變化

桉樹不同品系受桉樹枝癭姬小蜂脅迫前后，葉片中過氧化物酶（POD）活性變化的柱形圖可以看出（圖1），在未在遭受桉樹枝癭姬小蜂危害前，葉片內(nèi)的POD活性：高抗品系＞中抗品系＞高感品系，高抗品系和中抗品系葉片內(nèi)POD活性顯著高于高感品系，高抗品系葉片內(nèi)POD活性高于高感品系，但差異不顯著；隨著桉樹枝癭姬小蜂危害加劇，桉樹葉片內(nèi)POD活性呈逐月上升的趨勢(shì)，8月份測(cè)定數(shù)據(jù)表明，最大升高幅度達(dá)到受害前的180%，通過與對(duì)照相比，高抗品系葉片內(nèi)POD活性上升趨勢(shì)高于高感品系。方差分析結(jié)果表明：不同品系同一月葉片內(nèi)POD活性差異顯著，同一品系不同月份間葉片內(nèi)POD活性變化差異顯著（表2）。

圖1 不同桉樹品系在遭受桉樹枝癭姬小蜂后POD活性變化Fig.1 Variation of POD in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

2.3 桉樹不同品系超氧化物歧化酶活性的動(dòng)態(tài)變化

不同桉樹品系葉片中超氧化物歧化酶活性的變化見圖2，可以看出，桉樹品系在遭受桉樹枝癭姬小蜂危害前（即4月初），高抗品系、中抗品系葉片中SOD活性顯著高于高感品系， 中抗品系DH32-26、DH32-29、DH19-6以及雷11葉片中SOD活性顯著低于高抗品系，其他中抗品系葉片中SOD活性與高抗品系差異不顯著。隨著時(shí)間推移，在桉樹枝癭姬小蜂脅迫下，葉片中的SOD活性產(chǎn)生明顯的動(dòng)態(tài)變化。從總體變化趨勢(shì)看，所有品系葉片中SOD活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在小蜂危害初期，葉片中SOD活性迅速上升，上升幅度最高的達(dá)到50%，隨著小蜂危害加劇，到6月份，一部分品系葉片中SOD活性繼續(xù)升高，而部分葉片的SOD活性開始下降，進(jìn)入7、8月份，葉片中SOD活性整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，中抗品系Et09和Et12例外，其葉片中SOD活性持續(xù)升高。通過比較發(fā)現(xiàn)，高感品系葉片中SOD活性下降到低于危害前水平，而大部分高抗品系、中抗品系葉片中SOD活性雖出現(xiàn)下降，但均未低于危害前水平。

表2 不同桉樹品系葉片POD、SOD和PPO酶活性方差分析?Table 2 Variance anlysis and test of activities of POD,SOD and PPO among different strains

圖2 不同桉樹品系在遭受桉樹枝癭姬小蜂后SOD活性變化Fig.2 Variation of SOD in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

2.3 桉樹不同品系多酚氧化酶活性的動(dòng)態(tài)變化

由圖3可知，4月份，即桉樹不同品系在受桉樹枝癭姬小蜂危害前，感病品系多酚氧化酶活性（PPO）顯著低于高抗品系和中抗品系。5月份，進(jìn)入桉樹枝癭姬小蜂危害期，葉片內(nèi)PPO的活性升高，尤其是Et12、Et09、KX-12、廣9和粗皮桉5個(gè)品系PPO活性迅速升高，其PPO活性均達(dá)到受害前的1.5倍以上，隨著小蜂危害加劇，不同桉樹品系葉片內(nèi)PPO活性繼續(xù)升高，如A107、T121、D48等，同時(shí)，一些品系葉片內(nèi)PPO活性開始下降，如Et09，粗皮桉等，這說明葉片內(nèi)PPO活性隨危害時(shí)間變化不一致。從PPO活性動(dòng)態(tài)變化的柱形圖可以看出：葉片內(nèi)PPO活性都在5、6、7月份達(dá)到最高點(diǎn)，然后開始降低，但均高于其受害前水平。感病品系窿緣桉和DH201-2葉片內(nèi)PPO活性在不同月份均顯著低于高抗品系和中抗品系；中抗品系Et09、DH32-26、DH19-6和雷11葉片內(nèi)PPO活性顯著低于高抗品系，并顯著高于高感品系葉片內(nèi)PPO活性，其余中抗品系葉片內(nèi)PPO活性和高抗品系之間差異不顯著。

圖3 不同桉樹品系在遭受桉樹枝癭姬小蜂后PPO活性變化Fig. 3 Variation of PPO in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

3 結(jié)論與討論

SOD、POD和PPO都是普遍存在于植物體內(nèi)與植物抗逆性密切相關(guān)的代謝酶，許多研究者認(rèn)為，它們?cè)谥参锟共∠x中有重要意義，與植物的抗病蟲能力有著密切的關(guān)系[12-14]。

SOD和POD是植物體內(nèi)重要的活性氧防御酶，植物在正常狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)，因此防御酶體系也相對(duì)穩(wěn)定[15]。當(dāng)植物遭遇逆境時(shí)，產(chǎn)生大量的活性氧，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其它組分的嚴(yán)重?fù)p傷，因此，活性氧的清除對(duì)于維持正常的功能具有重要的意義，超氧物歧化酶能將O2-轉(zhuǎn)化為毒性較小的H2O2和O2，而過氧化物酶又可進(jìn)一步清除H2O2生成無害的H2O和O2，從而完成對(duì)生物體的保護(hù)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：24種不同桉樹品系在遭受桉樹枝癭姬小蜂危害后，葉片內(nèi)SOD活性和POD活性都產(chǎn)生了顯著變化。在受害前，桉樹葉片內(nèi)SOD活性、POD活性和PPO活性均表現(xiàn)為高抗品系＞中抗品系＞高感品系；受到小蜂危害后，葉片內(nèi)POD活性持續(xù)升高，升高增量排名前3的是A107、T121和DH42-6；葉片內(nèi)SOD活性出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，升高增量排名前3的品系是：檸檬桉、粗皮桉和Et12。方差分析表明：桉樹葉片內(nèi)防御酶活性的變化在不同抗性品系間差異顯著，表現(xiàn)為高抗品系＞中抗品系＞高感品系。

PPO在植物抗逆性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，可催化木質(zhì)素及其他酚類氧化產(chǎn)物的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽[17]；同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞受輕微破壞或組織衰老時(shí)，酚氧化酶與底物接觸，發(fā)生反應(yīng)形成棕褐色的醌，而醌類有對(duì)昆蟲進(jìn)行化學(xué)防御的生態(tài)功能，不利于昆蟲的取食和消化，有澀味，昆蟲不喜歡取食，可防止植食性昆蟲的侵食，所以多酚氧化酶高的林木表現(xiàn)為抗蟲，反之，感蟲[18-19]。本研究對(duì)24個(gè)桉樹品系在遭受小蜂前后，葉片內(nèi)PPO活性的變化進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，高抗品系、中抗品系葉片內(nèi)PPO活性明顯高于高感品系，在受到小蜂危害后PPO活性升高，說明桉樹在遭受枝癭姬小蜂侵害后，PPO活性被激活，參與了植物的自身保護(hù)機(jī)制；而在遭受危害一段時(shí)間后，葉片內(nèi)PPO活性出現(xiàn)下降，但高于危害前活性水平，這可能是由于桉樹葉片對(duì)該蜂危害產(chǎn)生的較快的應(yīng)激反應(yīng)，而后逐漸趨于穩(wěn)定。程璐等在研究苜蓿斑蚜對(duì)5種苜蓿品種防御酶活性的影響、武德功在研究不同苜蓿品種對(duì)豌豆蚜的生化抗性機(jī)制時(shí)都得出了PPO活性先下降后上升的變化趨勢(shì)[20-22]，程璐認(rèn)為PPO活性降低可能是受抗蚜蟲基因的控制；武德功等認(rèn)為PPO活性降低是被蚜蟲唾液分泌物所抑制，筆者認(rèn)為植物遭受害蟲危害后，植物葉片內(nèi)PPO活性升高是植物一種正常的應(yīng)激反應(yīng)過程，但為何在桉樹葉片內(nèi)PPO活性表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，是否是因PPO活性受到桉樹體內(nèi)抗性基因控制，將在抗性基因篩選過程中進(jìn)一步求證。

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Defense enzyme activity of 24 Eucalyptus varieties jeopardized by Leptocybe invasa Fisher & La Salle

WANG Wei, XU Jian-min, LI Guang-you, HAN Chao, WU Shi-jun, LU Zhao-hua
(Research Inctitute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

∶ 24 different resistant Leptocybe invasa Eucalyptus varieties were selected to study the effects of Leptocybe invasa hazards on the varieties activites of superxide dismutase, peroxidase and polyphenol oxidase. The results show the variation tendency of SOD,POD and PPO was a descending order: ‘high-resistant varieties, middle-resistant ones and high-sensitive ones before varieties were determined by Leptocybe invasa Fisher& La Salle. The activities of SOD and PPO in all varieties initially increased then declined when the varieties were invaded by Leptocybe invasa. The top three varieties of incremental increase were E. Citriodora, E.pellita and ET12.The top three which declines are Et09、DH32-29 and KX12. The activities of POD in all varieties initially increased to stabilize. The top three varieties of incremental decrease were A107、T121 and DH42-6.Variance analysis shows that there existed a huge difference of activities of defense enzymes’ variation between the high-resistant and high-sensitive. Activities of defense enzymes can be used as a biological and chemical target to assess the resistance of Eucalyptus to Leptocybe invasa.

∶ Eucalyptus varieties; Leptocybe invasa Fisher& La Salle; superxide dismutase; peroxidase; polyphenol oxidase

S763.43

A

1673-923X(2012)06-0024-05

2012-03-12

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“高產(chǎn)、抗逆桉樹新品種選育”(2012BAD01B0401); 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(RITFYWZX200904), 廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目“桉樹良種選育和高效栽培技術(shù)研究與示范”(2009KJCX004-02)

王 偉(1983—)，男，山西臨汾人，博士研究生，主要研究方向：桉樹抗性育種

徐建民(1964—)，男，云南楚雄人，研究員，博導(dǎo)，主要從事熱帶林木遺傳育種研究；E-mail: jianmxu@163.com

[本文編校：吳 彬]