仇 燕，劉紅霄，楊松燁

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

番茄高效再生體系的建立

仇 燕，劉紅霄，楊松燁

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

以砧木1號番茄的子葉和下胚軸為外植體進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，研究了IAA和6-BA及NAA和6-BA不同激素配比對外植體誘導(dǎo)不定芽及生根的影響。結(jié)果表明：培養(yǎng)基MS＋0.2 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA為誘導(dǎo)子葉外植體愈傷組織和不定芽的最適培養(yǎng)基，而 MS＋0.5 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA為誘導(dǎo)下胚軸外植體愈傷組織和不定芽的最適培養(yǎng)基；誘導(dǎo)不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為 MS＋0.1 mg／L IAA。

番茄；子葉；下胚軸；植株再生

番茄作為一種重要的蔬菜作物和模式經(jīng)濟(jì)作物已受到眾多研究者的關(guān)注，番茄轉(zhuǎn)基因的研究是當(dāng)前植物基因工程研究的熱點(diǎn)之一，番茄的廣泛栽培和它在遺傳理論上的深入研究，為基因工程拓寬資源打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)［1］。作為影響基因轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因素之一，建立高頻再生體系的研究一直很受重視［2］。

本試驗(yàn)選用砧木1號番茄種子，比較了不同殺菌劑和殺菌時間對番茄種子萌發(fā)的影響，確定了最佳殺菌劑及殺菌時間，并且以番茄無菌苗的下胚軸和子葉作為外植體，通過對不同激素濃度配比進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出能夠高效誘導(dǎo)番茄外植體直接分化不定芽和誘導(dǎo)不定芽生根的培養(yǎng)基，建立了一套高效的番茄植株再生體系，以期為進(jìn)一步的番茄轉(zhuǎn)基因和功能基因組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)基

砧木1號番茄種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。培育無菌苗使用含有去離子水的棉花基質(zhì)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，含有蔗糖質(zhì)量濃度30 g／L、瓊脂質(zhì)量濃度8 g／L，添加不同種類和濃度的激素，調(diào)節(jié)p H值至5.8。配制好的培養(yǎng)基于120℃高溫滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子的處理

選取籽粒飽滿的健康種子置于錐形瓶中，無菌水沖洗1次，70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）酒精處理20 s后分別用0.05%～0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氧化汞和10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaClO消毒，后用無菌水沖洗種子7遍。

1.2.2 無菌苗的培養(yǎng)

滅菌后的種子接種于棉花培養(yǎng)基上，25℃條件下（以下試驗(yàn)都是在該溫度條件下進(jìn)行）黑暗培養(yǎng)，5 d后計(jì)算發(fā)芽率，然后轉(zhuǎn)至光照周期14 h／d，光照度為2 000 lx的條件下培養(yǎng)，待幼苗子葉完全展開時備用。

1.2.3 外植體的準(zhǔn)備

取培養(yǎng)約10 d的無菌苗，將子葉兩端及葉邊緣切除，中間部分橫向切成2段，再在葉塊中間劃2處傷口；下胚軸剪成8 mm左右的切段。將切好的外植體接種在不同質(zhì)量濃度的附加IAA（0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）和6-BA（0.5 mg／L，1.0 mg／L，2.0 mg／L）及 NAA（0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）和6-BA（0.5 mg／L，1.0 mg／L，2.0 mg／L）的 MS培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種子葉和下胚軸各10塊，每個處理設(shè)3個重復(fù)。黑暗培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移至14 h／d光照周期條件下培養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計(jì)外植體的出愈率和不定芽的分化率。外植體的出愈率＝（誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%，不定芽的分化率＝（分化不定芽的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.4 生根培養(yǎng)

待不定芽長至2 cm左右時，切除不定芽基部的愈傷組織和培養(yǎng)基，將不定芽轉(zhuǎn)接到含有不同質(zhì)量濃度的IAA（0.05 mg／L，0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）或 NAA（0.05 mg／L，0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基中接種不定芽8塊，每個處理設(shè)3個重復(fù)，10 d后統(tǒng)計(jì)不同質(zhì)量濃度IAA或NAA培養(yǎng)基中不定芽的生根率。生根率＝（生根幼芽數(shù)／接種幼芽數(shù)）×100%，同時觀察根的形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑和滅菌時間對番茄種子滅菌及萌發(fā)的影響

NaClO處理過的種子表皮褪色變白，由表1可見，不同滅菌時間對種子的萌發(fā)影響不大，但是4～6 min處理后有少量霉菌污染；氯化汞處理過的種子較NaClO處理后的種子萌發(fā)晚且萌發(fā)率低，并且隨著氯化汞殺菌濃度的增大，時間的增長，種子的萌發(fā)率明顯降低，說明氯化汞處理對種子的萌發(fā)有一定的抑制作用。試驗(yàn)表明，最佳滅菌條件為70%酒精處理20 s后NaClO處理7 min。

表1 不同滅菌條件對種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effects for seeds germination with different sterilization condition

2.2 不同激素配比對番茄愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響

外植體接種5 d后，傷口處膨大，開始形成愈傷組織（見圖1和圖2）；13 d后，子葉外植體開始出現(xiàn)芽點(diǎn)并逐漸長成不定芽；18 d后，下胚軸開始出現(xiàn)芽點(diǎn)，不定芽開始生長（見圖3）。本試驗(yàn)選用NAA與6-BA的激素組合可以誘導(dǎo)外植體愈傷，但是誘導(dǎo)不定芽分化的效率卻極低，只能達(dá)到20%左右，且分化形成畸形芽較多，不能生長成完整植株。

由表2可見，在IAA與6-BA激素組合中，子葉與下胚軸出愈率相差不大。在不同激素濃度的培養(yǎng)基中，子葉外植體和下胚軸外植體的出愈率都在90%以上，下胚軸總體出愈率雖略低于子葉，但差異不明顯，在6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg／L時，下胚軸和子葉的出愈率都達(dá)到100%，說明該質(zhì)量濃度的6-BA最有利于愈傷的誘導(dǎo)。不同外植體誘導(dǎo)愈傷和不定芽分化的最佳激素配比并不相同：誘導(dǎo)子葉生芽的最佳激素組合是IAA（0.2 mg／L）＋6-BA（1.0 mg／L），出芽率高達(dá)97%；誘導(dǎo)下胚軸生芽的最佳激素組合是IAA（0.5 mg／L）＋6-BA（1.0 mg／L），出芽率達(dá)到77%。相同激素組合中，子葉與下胚軸分化不定芽的能力相差甚遠(yuǎn)，子葉作為外植體均比下胚軸誘導(dǎo)再生芽的效率高，特別是在本試驗(yàn)的最優(yōu)條件下（子葉在5號培養(yǎng)基，下胚軸在6號培養(yǎng)基）子葉的出芽率比下胚軸高20%。

表2 不同激素配比對番茄愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different combination of hormone concentration on tomato callus and buds induction

2.3 不同激素及濃度對番茄外植體生根的影響

待培養(yǎng)的幼芽長到2 cm左右且具有2－3個葉片時，切除不定芽下的愈傷組織，將不定芽轉(zhuǎn)接到不同濃度的IAA或NAA生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根（圖4）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入IAA的培養(yǎng)基比加入NAA的培養(yǎng)基更有利于番茄不定芽的生根誘導(dǎo)，不僅生根時間短，再生根也比較粗壯。由表3可見，當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為0.05 mg／L時，誘導(dǎo)的主根較細(xì)；質(zhì)量濃度為0.1 mg／L時，誘導(dǎo)的主根較粗且根系發(fā)達(dá)、須根多，再生苗也較高；質(zhì)量濃度為0.2 mg／L時，根系依舊很發(fā)達(dá)，但再生苗高度比0.1 mg／L時低；質(zhì)量濃度為0.5 mg／L時，根系較弱，基本無須根，并且生根率明顯低于其他濃度。這種變化說明適當(dāng)提高IAA濃度有利于不定芽的生根，但是超過一定質(zhì)量濃度后，反而會抑制根的發(fā)生。故筆者認(rèn)為0.1 mg／L為誘導(dǎo)不定芽生根的最佳IAA質(zhì)量濃度。

待番茄幼苗生長到6～8 cm，根長為5～6 cm時，打開錐形瓶封口膜，在錐形瓶中注入約0.5 cm水后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中進(jìn)行馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為白天24℃夜間18℃，光照周期為14 h／d（見圖5）。2～3 d后，從錐形瓶中取出小苗洗去根部培養(yǎng)基防止細(xì)菌滋生，將再生植株轉(zhuǎn)移到注入1 cm水的錐形瓶中，室溫（20～25℃）下生長。4 d后，移栽到營養(yǎng)土中（見圖6），移栽成活率達(dá)到100%。

表3 不同濃度IAA對不定芽生根的影響Tab.3 Effect of IAA concentration on adventitious buds generating roots

3 討 論

3.1 不同滅菌劑對番茄種子發(fā)芽的影響

獲得無菌苗是植株再生的第1個步驟，以往番茄種子的滅菌主要以氯化汞滅菌法為主，但也有報道指出氯化汞對種子的萌發(fā)可能有一定的抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl O處理的種子比氯化汞處理的種子發(fā)芽時間更短，發(fā)芽率更高。氯化汞抑制種子萌發(fā)的原因可能在于氯化汞在種子表面的殘留不易去除，從而導(dǎo)致種子不能萌發(fā)，而次氯酸鈉最后分解成氯和氧氣排入大氣中，滅菌后易于去除［3］，不會再損傷種子。

3.2 不同外植體再生能力的比較

番茄的不同部位外植體再生能力不盡相同，梁美霞發(fā)現(xiàn)番茄下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)均低于子葉誘導(dǎo)，這與本試驗(yàn)得出的結(jié)論是一致的［4］。而子葉作為外植體比下胚軸更容易形成不定芽的原因可能在于子葉是營養(yǎng)儲存器官，可以為芽的生長提供更為充足的營養(yǎng)［5］。歐陽波等的研究則相反［6］，這可能與不同番茄品種的內(nèi)源激素的含量和種類有關(guān)。陳火英等的實(shí)驗(yàn)證明離體培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)生過程中，物理創(chuàng)傷作用對啟動愈傷組織有明顯的作用［7］，故在制備外植體時應(yīng)盡量多的制造外植體傷口，本試驗(yàn)不僅切除了子葉的邊緣同時在子葉切塊的中部也劃出傷口，以利于外植體的再生培養(yǎng)。

3.3 不同激素配比對外植體生芽及生根的影響

不同激素配比是影響番茄外植體再生的重要因素之一，有關(guān)番茄離體培養(yǎng)激素調(diào)控方面的研究一直在進(jìn)行。王月等以番茄子葉和下胚軸為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，篩選出ZR與IAA的組合最有利于愈傷組織和不定芽的形成，添加IBA的培養(yǎng)基利于誘導(dǎo)不定芽生根［8］；而喬永旭則認(rèn)為，IAA與6-BA的組合有利于番茄外植體不定芽的生長，而生根培養(yǎng)基中添加的則是IAA［9］，畢建水等的實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)論［10］。本試驗(yàn)的研究中也發(fā)現(xiàn)IAA與6-BA的組合比NAA與6-BA的組合更有利于番茄外植體再生芽的誘導(dǎo)，同時，IAA誘導(dǎo)不定芽生根的作用也比NAA更顯著。這一現(xiàn)象表明，番茄外植體誘芽的最佳激素組合有基因型依賴性，不同的品種其再生的條件不同。要建立適合當(dāng)?shù)貧夂虻姆哑贩N的再生體系，必須對其再生體系進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

3.4 再生植株的馴化和移栽

如2.3部分中再生植株移栽過程，可有利于保持再生植株的濕度，相對于直接移栽到營養(yǎng)土中的植株更易成活，4 d后，再生植株移栽到營養(yǎng)土中。移栽時試管苗的高度一般在6～10 cm，過高過低都不適合移栽，根系的發(fā)育程度是移栽成功與否的決定因素，移栽時應(yīng)盡量選擇根系較發(fā)達(dá)的再生植株。

3.5 形成再生植株的周期及效率

本試驗(yàn)誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化都在同一培養(yǎng)基中進(jìn)行，建立了高效的番茄再生體系，子葉在最佳培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽和根的效率分別達(dá)到了97%和96%。有些報道也可以得到高達(dá)95%以上的再生率，但是，這些報道有的是經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽［9－11］，有的統(tǒng)計(jì)分化不定芽率時間較長［8，12］，這樣從接種外植體到植株移栽大概需要70～85 d的時間。本研究中，子葉外植體在最適宜的6-BA和IAA組合上從接種外植體到轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基約需35 d，芽誘導(dǎo)生根約需15 d，再生苗鍛煉5～7 d后移栽，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株的整個過程約需55 d，加快了再生植株的形成過程縮短了周期，同時提高了再生效率，為番茄快速繁殖和轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］何秀霞，陸一鳴，白杰英，等.番茄組織培養(yǎng)體系的建立及其影響因素的研究［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報（Journal of Inner Mongolia University for Nationalities），2003，18（1）：30-33.

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Establishment of highly efficient regeneration system of tomato

QIU Yan，LIU Hong-xiao，YANG Song－ye
（College of Bioscience and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China）

The effects of medias containing different concentration of IAA and 6-BA or NAA and 6-BA on tomato callus induction，bud differentiation and rooting were detected in hypocotyl and cotyledon of Zhenmu No.1.The results show that MS＋0.2 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA is the best medium for callus induction and bud differentiation of cotyledon；MS＋0.5 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA is the optimum medium for callus induction and bud differentiation of hypocotyl；the optimum root induction medium is MS＋0.1 mg／L IAA.

tomato；cotyledon；hypocotyl；plant regeneration

S641.2

A

1008-1542（2012）01-0083-06

2011-05-27；

2011-11-09；責(zé)任編輯：王海云

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2010000860）

仇 燕（1977-），女，河北井徑人，副教授，博士，主要從事植物種質(zhì)創(chuàng)新方面的研究。