王曉林，鐘方麗，孫 威，王慧竹

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

東北鐵線蓮總多酚的超聲提取工藝研究

王曉林，鐘方麗，孫 威，王慧竹

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

探索超聲波輔助提取東北鐵線蓮總多酚的最佳工藝條件。以東北鐵線蓮總多酚的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)法確定了東北鐵線蓮中總多酚的最佳工藝，采用分光光度法對提取液中總多酚的含量進(jìn)行了測定，檢測波長為766 nm。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件中乙醇濃度為55%（體積分?jǐn)?shù)），提取時(shí)間為35 min，料液比（質(zhì)量比）為1∶30，提取次數(shù)為3次。沒食子酸在質(zhì)量濃度為1.116～11.160μg／m L時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該提取方法操作簡單，結(jié)果比較可靠，適用于東北鐵線蓮總多酚的提取。

東北鐵線蓮；總多酚；超聲提取；正交試驗(yàn)法；沒食子酸

東北鐵線蓮（ClematisManshuricaRupr.）是毛茛科鐵線蓮，屬多年生蔓生草本植物，別名辣蓼鐵線蓮、山辣椒秧子，其干燥根及根莖入藥，藥材名為威靈仙，廣泛分布于中國東北三?。?－2］。威靈仙為傳統(tǒng)常用中藥之一，化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，具有降壓、降糖、降血清膽固醇、利尿、抗菌、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、解痙、抗腫瘤、利膽等作用［3－5］，常用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)不利、四肢麻木、扁桃體炎及食道癌等疾病的治療［6－7］。植物多酚具有較強(qiáng)的抗氧化作用以及明顯的抑菌、抗癌、抗老化和抑制膽固醇升高等功效。超聲波輔助提取是一種新的萃取技術(shù)，具有提取時(shí)間短、提取效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然香料、植物酶、中草藥活性成分等的提?。?］。筆者以東北鐵線蓮總多酚的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素、正交試驗(yàn)法優(yōu)化了超聲輔助提取東北鐵線蓮總多酚的工藝條件，為進(jìn)一步利用和研究東北鐵線蓮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JBT／C-YCL型超聲波藥品處理機(jī)（山東濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司提供）；R-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠提供）；W5-100SP型恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司提供）；BS-600L型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司提供）；752N型三用紫外分析儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司提供）；RT-08型多功能粉碎機(jī)（臺(tái)灣榮聰精密科技有限公司提供）。

1.2 材料

沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用）；東北鐵線蓮（安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司提供）；東北鐵線蓮的干燥根（經(jīng)吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為毛茛科鐵線蓮屬）；無水碳酸鈉，鎢酸鈉，鉬酸鈉，硫酸鋰，乙醇等，所用試劑均為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多酚含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品2.79 mg，置于50 m L棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解，并定容至刻度，即得沒食子酸對照品溶液（1 m L溶液中含沒食子酸0.055 8 mg）。

2.1.2 供試品溶液的制備

取干燥后的東北鐵線蓮粉末2.5 g，稱定，置于錐形瓶中，加50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇適量，超聲提取2次，超聲溫度為40℃。過濾，合并濾液，濃縮，冷卻，定容至50 m L的容量瓶中，搖勻。吸取1.0 m L，置于50 m L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.3 Folin-Cioealteu試劑（磷鉬鎢酸試液）的制備

在圓底燒瓶中加入鎢酸鈉50 g，鉬酸鈉12.5 g，蒸餾水350 m L，濃磷酸25 m L，濃鹽酸50 m L，充分混勻，水浴回流10 h。再加入硫酸鋰75 g，蒸餾水25 m L，溴水?dāng)?shù)滴，開口繼續(xù)沸騰15 min，使溴水揮發(fā)完全為止。冷卻，過濾，定容至500 m L棕色容量瓶中。將此溶液置于冰箱中保存，使用時(shí)加入1倍體積的蒸餾水。

2.1.4 檢測波長的選擇

取供試品溶液及對照品溶液各5 m L，放入50 m L容量瓶中，用水稀釋至刻度，再吸取此溶液5 m L，置于25 m L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。取該溶液1.0 m L，置于10 m L的容量瓶中，加4 m L蒸餾水，再加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，在波長400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者最大波長均為766 nm，故確定檢測波長為766 nm。

2.1.5 分析方法

精確量取1.0 m L樣品溶液，放入10 m L容量瓶中，加4 m L蒸餾水，再加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。按照分光光度法，在766 nm波長處測定其吸光度［9］。

2.1.6 線性關(guān)系考察

精確吸取沒食子酸對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 m L，放入25 m L容量瓶中，加適量蒸餾水，再分別加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白，在766 nm波長下測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為A＝0.086 28ρ＋0.029 19，R＝0.999 5。

2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.004 64 mg／m L的對照品溶液，按“2.1.5”所述方法，連續(xù)測定5次吸光度，得知RSD值為0.13%（n＝5），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于配制后的0，30，60，120，180，240 min，按“2.1.5”所述方法測定吸光度。結(jié)果表明，供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定，然后穩(wěn)定性下降，但在60～180 min時(shí)吸光度值比較穩(wěn)定，所以供試品溶液配制完成后應(yīng)盡快進(jìn)行吸光度的測定。

2.1.9 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的藥材粉末5份，按“2.1.2”所述方法制備，按“2.1.5”所述方法進(jìn)行測定，得知RSD值為1.65%（n＝5），結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.56%）的樣品各0.5 g，共5份，精密加入沒食子酸對照品27.6 mg，按“2.1.2”所述方法制備，按“2.1.5”所述方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果Tab.1 Experimental results of recovery test

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選東北鐵線蓮總多酚超聲輔助提取工藝

2.2.1 因素及水平考察

通過單因素探索試驗(yàn)，分別對料液比（質(zhì)量比）（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50），提取時(shí)間（10，20，30，40，60 min），提取次數(shù)（1，2，3，4，5），乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%，50%，60%，75%，90%）等因素和水平進(jìn)行了探索。以東北鐵線蓮總多酚的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定較好的提取因素與水平如下：料液比為1∶20，提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。單因素探索結(jié)果可作為確定正交試驗(yàn)因素與水平數(shù)的重要依據(jù)。根據(jù)單因素探索性試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)定因素水平表，見表2。

表2 因素及水平表Tab.2 Table of factors and levels

2.2.2 提取方法

取東北鐵線蓮粉末2.5 g，按L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行提取，合并提取液，過濾。將濾液濃縮至50 m L，按“2.1.2”所述方法制備供試品溶液，按“2.1.5”所述方法測定提取液中總多酚的含量，進(jìn)而得出提取的總多酚的質(zhì)量和總多酚提取率，總多酚提取率＝總多酚質(zhì)量／東北鐵線蓮藥粉質(zhì)量×100%。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal experiments

以東北鐵線蓮總多酚的提取率為指標(biāo)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，由表3可知適宜的實(shí)驗(yàn)條件為A3B3C3D3。因?yàn)樗械囊蛩厮骄鶠樽罡唿c(diǎn)，故不能確定所得實(shí)驗(yàn)條件是否為最佳條件，通過補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。由于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明提取3次已將東北鐵線蓮中總多酚提取完全，所以提取次數(shù)固定為3次，由于其他條件均為最高點(diǎn)，故每個(gè)因素均進(jìn)行第4水平實(shí)驗(yàn)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，其他3個(gè)因素都用最佳實(shí)驗(yàn)條件；提取時(shí)間為40 min，其他3個(gè)因素都用最佳實(shí)驗(yàn)條件；溶劑用量為35倍，其他3個(gè)因素都用最佳實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of supplementary experiments

結(jié)果表明，第4水平實(shí)驗(yàn)并未明顯提高東北鐵線蓮中總多酚的提取率。所以確定東北鐵線蓮中總多酚的最佳提取條件如下：料液比（質(zhì)量比）為1∶30，提取時(shí)間為35 min，提取次數(shù)為3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%。

2.2.3 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝條件的穩(wěn)定性，按優(yōu)化工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，然后各取30 m L提取液，倒入稱重后的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，待其干燥至恒重后稱重，由差值得到浸膏質(zhì)量，計(jì)算干浸膏總多酚的含量，結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：東北鐵線蓮中總多酚的提取率分別為5.55%，5.56%，5.33%，平均提取率為5.48%，干浸膏中總多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.48%，23.49%，22.53%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.17%。這表明優(yōu)化的工藝條件重現(xiàn)性高，穩(wěn)定可靠。

3 討 論

3.1 料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

單因素實(shí)驗(yàn)中料液比（質(zhì)量比）分別設(shè)定為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，提取時(shí)間分別設(shè)定為5，10，20，30，40，60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為30%，50%，60%，75%，90%。結(jié)果表明：料液比（質(zhì)量比）為（1︰20）～（1︰40）時(shí)，總多酚提取率較高且比較穩(wěn)定；提取率隨提取時(shí)間的延長而增加，在30 min時(shí)提取率最高；乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)提取率最高。所以在正交試驗(yàn)中選擇料液比（質(zhì)量比）為1∶20，1∶25，1∶30，提取時(shí)間為25，30，35 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，50%，55%，進(jìn)一步考察各因素對提取效果的影響。

3.2 提取次數(shù)的選擇

單因素實(shí)驗(yàn)中提取次數(shù)的考察按如下方案進(jìn)行：稱取東北鐵線蓮藥材粉末約2.5 g，量取20倍量50%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇，分別提取1，2，3，4，5次，每次超聲（40℃）30 min，過濾。把每次的濾液定容至50 m L的容量瓶中，按“2.1.2”所述方法制備供試品溶液，按 “2.1.5”所述方法測定提取液中總多酚的含量，進(jìn)而得出提取的總多酚質(zhì)量和總多酚提取率。結(jié)果表明：提取3次可以將東北鐵線蓮總多酚提取完全，其中前2次即可提取總量的89%。

4 結(jié) 語

通過正交試驗(yàn)法對東北鐵線蓮總多酚的超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并按最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果證明，該工藝提取東北鐵線蓮總多酚路線簡單、提取率高、操作容易控制、穩(wěn)定性好，為東北鐵線蓮總多酚提取的工業(yè)生產(chǎn)提供了合理依據(jù)。

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Study on extraction technology of total polyphenols inClematisManshuricaRupr.

WANG Xiao-lin，ZHONG Fang-li，SUN Wei，WANG Hui-zhu
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin Jilin 132022，China）

This paper is to establish the optimum extraction technology of total polyphenols（TP）inClematismanshurica Rupr.by ultrasonic extraction method.By using the extraction efficiency of TP inClematismanshuricaRupr.as evaluating indicator，some important factors，such as the concentration of ethanol，the extracting time，the ratio between raw material and solvent and the extracting times，are optimized by orthogonal experimental design.The content of TP inClematismanshurica Rupr.is determined by spectrum photometric method at detection wavelength of 766 nm.The optimum extraction condition of TP inClematismanshuricaRupr.with ultrasonic method are obtained as follows：the concentration of ethanol，the extracting time is 35 min，the ratio of raw material to solvent is 1∶30，and the extraction times is 3 times is 55%.The concentration of gallic acid and its absorption value shows a good linear relationship at the range of 1.116～11.160μg／m L.It is concluded that the ultrasonic extraction method obtained in the paper is easy to operate and reliable，so it could be used for extracting TP inClematismanshuricaRupr.

ClematisManshuricaRupr.；total polyphenols（TP）；ultrasonic extraction；orthogonal experimental design；gallic acid

R282.71

A

1008-1542（2012）01-0032-04

2011-08-31；

2011-11-16；責(zé)任編輯：張士瑩

王曉林（1969-），男，山東五蓮人，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及純化工藝方面的研究。

鐘方麗教授。E-mail：fanglizhong＠sina.com