李鳳娟，周日寶*，劉湘丹，劉笑蓉，王朝暉，孫夢(mèng)姍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長(zhǎng)沙 410208）

不同采收期菝葜中黃酮類(lèi)成分含量動(dòng)態(tài)變化的研究

李鳳娟，周日寶*，劉湘丹，劉笑蓉，王朝暉，孫夢(mèng)姍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 以黃酮類(lèi)含量為指標(biāo)，確定菝葜根莖藥材的最佳采收期。方法 以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同采收期菝葜根莖中總黃酮含量，并采用HPLC測(cè)定其中落新婦苷和黃杞苷的含量。結(jié)果 11月中旬以前總黃酮含量明顯低于11月中旬以后；10～11月初隨著生育期延長(zhǎng)菝葜根莖中總黃酮含量略有下降，11月份以后菝葜根莖中總黃酮含量不斷積累，至12月底菝葜進(jìn)入休眠期后菝葜根莖中總黃酮的含量最高，達(dá)3.0%±0.1%。菝葜根莖藥材中落新婦苷和黃杞苷的總含量大于0.10%，符合2010版《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定，在12月底含量達(dá)到最大值。結(jié)論 菝葜藥材的最佳采收期應(yīng)為菝葜地上部位落葉枯萎，根莖進(jìn)入越冬休眠期后采收。

菝葜；黃酮類(lèi)成分；含量測(cè)定；紫外-可見(jiàn)分光光度法；HPLC；不同采收期

菝葜系百合科菝葜屬植物，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，其根莖、葉均可入藥，尤以根莖為大宗常用中藥。菝葜根莖主要包含皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)等[1-2]多種化學(xué)成分，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀等藥理活性[3]，性甘、酸、平、溫。為了更好地了解菝葜藥材的最佳采收期，現(xiàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同采收期菝葜根莖中總黃酮的含量，同時(shí)以落新婦苷和黃杞苷為指標(biāo)，采用RPHPLC測(cè)定同一地區(qū)不同采收期菝葜根莖中兩種成分的含量，以期為野生撫育基地菝葜根莖藥材最佳采收期的確定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；752pc型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）；Agilent Technologies 1200series（美國(guó)進(jìn)口）。

1.2 試驗(yàn)試劑

甲醇為色譜純；其它試劑為分析純；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品研究所，批號(hào)：10080-200707）；落新婦苷對(duì)照品、黃杞苷對(duì)照品（天津馬克生物技術(shù)有 限 公 司 ， 批 號(hào) ：TFL-1-20110226、TFL-2-20110226，純度 98.5%)；超純水為自制。

1.3 樣品材料

樣品材料采自湖南省平江縣菝葜藥材野生撫育基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為菝葜Smilax china L.的根莖。供試品：取上述菝葜根莖洗凈，于60℃烘干，粉碎并過(guò)40目篩后，裝入塑料封口袋中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取于120℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品10.0mg，置100 mL量瓶中，加入70%乙醇50 mL，置溫水中加熱使溶解，放冷，加70%乙醇定容，搖勻，即得0.100mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取供試品約3 g，精密稱定，加70%乙醇90 mL，超聲提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇至濾液100 mL以下，用70%乙醇定容于100 mL量瓶中，精密吸取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，移入分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取5次，每次10 mL。合并乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶解并定容至50 mL。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各3 mL，分別置10 mL量瓶中，加乙醇2 mL，加5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4 mL，加乙醇至刻度，搖勻，放置 15min，于 400～700 nm處掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液在495 nm處均有較強(qiáng)吸收峰（見(jiàn)圖1）。故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為495 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10mL量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，于495 nm測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：

在 0.010～0.060mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度具有良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一蘆丁對(duì)照品溶液3 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定吸光度，RSD=0.60%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色， 分別在 0、15、30、45、60、120min 時(shí)測(cè)定其吸光度。結(jié)果表明在顯色后15～60min其吸光度的RSD為2.7%，表明供試品溶液宜在顯色15min后開(kāi)始測(cè)定，并于60min內(nèi)完成測(cè)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品 （采收期為2010.11.01）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定，用回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果菝葜中總黃酮平均含量為2.06%，RSD為1.6%（n=6）。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知總黃酮含量的菝葜根莖藥材粉末 （采收期為2010.11.01）0.5 g，共5份，分別精密加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.9 含量測(cè)定 取不同采收期的菝葜供試品，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算供試品中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （mg，n=5）

表2 不同采收期菝葜根莖藥材中總黃酮、落新婦苷和黃杞苷含量（，n=3，mg/g）

表2 不同采收期菝葜根莖藥材中總黃酮、落新婦苷和黃杞苷含量（，n=3，mg/g）

樣品采收期 總黃酮含量 落新婦苷含量 黃杞苷含量 落+黃總含量2010.10.01 20.667±0.335 1.117±0.010 6.927±0.017 8.044±0.0272010.10.11 25.687±0.273 1.355±0.015 8.010±0.057 9.365±0.0692010.10.21 24.424±0.501 0.748±0.012 3.642±0.018 4.390±0.0302010.11.01 20.627±0.263 0.854±0.006 3.696±0.016 4.550±0.0222010.11.11 26.778±0.350 0.614±0.006 4.192±0.012 4.806±0.0182010.11.21 27.674±0.474 1.434±0.014 6.544±0.064 7.978±0.0782010.12.01 29.365±0.441 1.392±0.011 7.833±0.027 9.225±0.0382010.12.11 29.909±0.670 1.213±0.013 6.141±0.046 7.354±0.0592010.12.21 29.959±0.490 1.114±0.013 6.778±0.025 7.892±0.0382011.01.01 31.385±0.639 1.917±0.01812.309±0.02314.226±0.0412011.01.11 30.059±0.375 1.678±0.022 7.837±0.057 9.515±0.079

2.2 落新婦甘和黃杞苷含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件[3]色譜柱Apollo C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60）；流速為 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 290 nm；柱溫為35℃。在上述色譜條件下，分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入色譜儀，對(duì)照品及樣品溶液的HPLC色譜圖如圖2和圖3所示。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取落新婦苷、黃杞苷對(duì)照品適量，用甲醇定容，分別制成0.04mg/mL落新婦苷對(duì)照品溶液和0.3mg/mL的黃杞苷對(duì)照品溶液，再分別精密吸取落新婦苷和黃杞苷對(duì)照品溶液25 mL于50 mL容量瓶中，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試液的制備 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 （功率250 W，頻率40 kHz）45min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取落新婦苷和黃杞苷對(duì)照品溶液 1、2、3、5、10、20 μL 進(jìn)樣， 測(cè)定落新婦苷和黃杞苷峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，得到落新婦苷的回歸方程為Y=2523.6X-0.1067，r=1.0000，黃杞苷的回歸方程為Y=3721.6X-0.1058，r=1.0000。落新婦苷和黃杞苷分別在 0.02～0.40 μg 和 0.15～3.01 μg 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 樣品含量測(cè)定 采用上述色譜條件，對(duì)菝葜樣品進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算落新婦苷和黃杞苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

對(duì)來(lái)自湖南省平江縣野生撫育基地的11批不同采收期菝葜根莖中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析可知，不同采收期菝葜根莖中總黃酮含量較高，均在2.0%以上，11月中旬以前總黃酮含量明顯低于11月中旬以后；10月至11月初隨著生育期延長(zhǎng)，總黃酮含量略有下降，11月份以后總黃酮含量不斷積累，至12月底菝葜進(jìn)入休眠期后菝葜根莖中總黃酮的含量最高，達(dá)3.0%以上，后期總黃酮含量的不斷增加，可能是地上部分莖葉中的黃酮不斷運(yùn)輸至地下根莖中不斷積累的結(jié)果。菝葜藥材的最佳采收期應(yīng)為地上部位落葉枯萎，根莖進(jìn)入越冬休眠期后采收，與傳統(tǒng)的采收方法一致[3]。

湖南省平江縣菝葜藥材野生撫育基地不同采收期菝葜根莖中落新婦苷和黃杞苷的總含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了2010版 《中國(guó)藥典》的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn) （總量不少于0.10%），此外，筆者還對(duì)菝葜樣品進(jìn)行了水分、灰分、浸出物等常規(guī)測(cè)定，結(jié)果均符合2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該野生撫育基地生產(chǎn)的藥材是優(yōu)質(zhì)的，適宜大規(guī)模開(kāi)展菝葜藥材的野生撫育或菝葜野生變家種的人工栽培。

[1]干國(guó)平，于偉，孫進(jìn)，等.不同產(chǎn)地菝葜中總黃酮的含量考察[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（23）：2055-2056.

[2]干國(guó)平，于偉，江維，等.菝葜化學(xué)成分的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，6(6)：1404-1405.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：290.

Research on dynamic changes of flavonoids contents in Smilax China L.from different harvest time

LI Feng-juan,ZHOU Ri-bao*,LIU Xiang-dan,LIU Xiao-rong,WANG Zhao-hui,SUN Meng-shan
（TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208，China）

Smilax China L.； flavonoids； quantitative determination； ultraviolet-visible spectrophotometry； HPLC； different harvest time

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.010.038.04

〔Absrract〕Objective To determine the optimum harvest time of Smilax China L using the flavonoids content as an index.Methods The content of total flavonoids in Smilax china L.was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry with rutin as standard control，and astilbin and engeletin in SmilaxChinaL.weredetermined usingHPLC method.ResultsThetotal flavonoids content of Smilax China L.harvested before the mid-November is markedly lower than that of harvested after the mid-November. As the growth period extending，the total flavonoids content in the rhizome of Smilax China L.gradually reduced from October to the begin ning of November，but the flavonoids content constantly accumulated after November and reached the peak when the rhizome of Smilax China L.entered hibernation at the end of December，which is 3.0%±0.1%.The total content of astilbin and engeletin in the rhizome of Smilax China L.was more than 0.10%，which complied with the quality standards in the 2010 edition of the China pharma copoeia，and the content reached the peak at the end of December.Conclusion The Smilax Chi na L.may be collected atthe time thatSmilax China L.leaves has fallen and the above-ground has withered，and the rhizome has entered winter hibernation.

2012－07－21

湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金（09k061）；湖南省中醫(yī)藥管理局（2009010）。

李鳳娟（1986-），女，河南周口人，在讀碩士研究生，主要從事中藥資源與質(zhì)量研究。

* 周日寶，男，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhouribao20032003@yahoo.com.cn。

（本文編輯 楊 瑛）