陳慶勇，陽玉萍，向陽冰，譚國萍，張 華

(臨床研究)

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1 rs2071480基因多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族變應(yīng)性鼻炎相關(guān)性研究

陳慶勇，陽玉萍，向陽冰，譚國萍，張 華

目的 近年來抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1(transporter－associated with antigen processing 1，TAP1)rs2071480位點(diǎn)基因多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)遺傳易感性的關(guān)系備受關(guān)注，但由于遺傳和表型上的異質(zhì)性，不同研究所獲結(jié)果不盡一致，呈現(xiàn)的差異可能與種族有關(guān)。文中探討新疆地區(qū)漢族人群TAP1*rs2071480位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布特點(diǎn)及與AR的關(guān)系。 方法 采用病例－對照研究方法，應(yīng)用SNaPshot SNP分型技術(shù)對300名漢族人TAP1*rs2071480進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型，其中病例組150人，健康對照組150人。結(jié)論TAP1*rs2071480基因頻率在病例組和健康對照組分布符合Hardy－Weinberg平衡定律。組間基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果TAP1 2071480基因單核苷酸多態(tài)性可能與新疆地區(qū)漢族人群易患AR無關(guān)。

抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1;單核苷酸多態(tài)性;變應(yīng)性鼻炎;漢族

0 引 言

AR屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，其發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素共同作用有關(guān)，但詳盡的發(fā)病機(jī)制仍有待深入研究。目前認(rèn)為AR是多基因遺傳性疾病，IgE、T細(xì)胞受體、細(xì)胞因子及相應(yīng)的受體等可能參與其發(fā)病機(jī)制［1－2］。近期研究提示人類抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(transporter－associated with antigen processing1，TAP1)的基因多態(tài)性與AR易感性和嚴(yán)重性相關(guān)，在AR發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用［3－4］。本文采用SNaPshot SNP方法分析新疆漢族人群TAP1基因多態(tài)性，探討rs2071480基因位點(diǎn)多態(tài)性與新疆漢族AR的相關(guān)性及AR可能的遺傳易感機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 在新疆居住滿1年以上的漢族人，2周內(nèi)未服用皮質(zhì)類固醇、抗組胺藥，無風(fēng)濕性疾病、高血壓、糖尿病及其他與組織相容性抗原相關(guān)疾病。本研究得到新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書。①AR病例組:新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科門診就診的無血緣關(guān)系的漢族AR患者150名，其中男性79名，女性71名，年齡5～80歲，平均(35.03± 14.28)歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會2009年AR診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。完成AR專業(yè)問卷，行前鼻鏡檢查、皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(阿羅格公司試劑)、血清總IgE檢測。②健康對照組:在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢的健康人150名，其中男59名，女91名，年齡2～76歲，平均(35.37±17.37)歲，詢問病史，排除AR。行前鼻鏡、皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)等檢查。

1.2 主要試劑及儀器 血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物公司)，引物(上海生工公司)，dNTP (Generay Biotech公司)，Hotstar Taq(Qiagen公司)。3130xl genetic分析儀(ABI公司)，BG－Power 300電泳儀(北京百晶生物科技有限公司)，F(xiàn)R－250電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司)，F(xiàn)R－110紫外分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)，BG－submix cell電泳槽(北京百晶生物科技有限公司)，2720熱循環(huán)儀(ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 外周血白細(xì)胞DNA的提取制備 抗凝血5 ml加入10 ml淋巴細(xì)胞分離液，水平離心機(jī)離心半徑20 cm，1500 r/min，離心30 min，收集白細(xì)胞，用PBS洗滌2遍。應(yīng)用氯仿法提取白細(xì)胞中的DNA，嚴(yán)格按照試劑盒操作。加TE溶解DNA，－20℃保存。FR－110紫外分析裝置對DNA樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計(jì)并標(biāo)化至濃度5～10 ng/μl。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 序列特異性引物(sequence－specific primer，SSP)用Primer3軟件設(shè)計(jì)，上海生工公司合成。rs2071480位點(diǎn)的引物序列如下:

1.3.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為10 μl，包含1×GC緩沖液I(Takara公司)，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol dNTP，1 U HotStarTaq聚合酶(Qiagen公司)，1 μl樣本DNA和1 μl多重PCR引物。多重PCR引物濃度:2 μM。PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)條件和循環(huán)程序如下。95℃變性2 min;94℃變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行11個循環(huán)，94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行24個。最后72℃延伸2 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物純化方法在10μl PCR產(chǎn)物中加入SAP酶1U和Exonuclease I酶1U，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。

1.3.4 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng) 延伸引物SF序列為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTTGCGCGCGGCGCTAAC延伸反應(yīng)體系為10 μl，包括SNaPshot Multiplex Kit(ABI公司)5 μl，純化后多重PCR產(chǎn)物2μl，延伸引物混和物1μl(引物濃度1.6 μmol)，超純水2 μl。PCR循環(huán)程序;96℃預(yù)變性1min;96℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸30 s，28個循環(huán)，4℃保存。延伸產(chǎn)物純化:在10 μl延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。延伸產(chǎn)物測序:取0.5 μl純化后的延伸產(chǎn)物與Liz120標(biāo)準(zhǔn)液0.5 μl、Hi－Di 9 μl混勻，95℃變性5 min。用ABI3130XL測序儀測序。收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0軟件(美國AppliedBiosystems公司)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用PHASE2.0推斷單倍型，用Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本遺傳平衡狀態(tài)及基因頻率代表性。新疆漢族人群基因頻率與NCBI基因庫中其他種族人群基因型及基因頻率分布差異比較用χ2檢驗(yàn)。估計(jì)基因型頻率計(jì)算等位基因頻率。組間基因頻率和等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 漢族個體tSNP及單堿基電泳峰型圖 TAP1 rs2017480位點(diǎn)電泳峰型見圖1，TAP1 rs2017480位點(diǎn)單堿基延伸電泳峰型見圖2。

圖1 漢族不同SNP單堿基延伸電泳峰圖Figure 1 SNaPshot electropherographic results of SNPs in Han people

圖2 rs2017480位點(diǎn)單堿基延伸電泳峰型Figure 2 SNaPshot electropherographic results of rs2017480 (T/T，G/G，G/T)

圖中橙色峰為標(biāo)準(zhǔn)峰型，藍(lán)色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入 ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產(chǎn)物，峰下面的標(biāo)注為等位基因。延伸引物為正向者，即與加入的堿基一致，如延伸引物為反向者，則與加入的堿基互補(bǔ)。

2.2 TAP1 rs2071480基因型及等位基因的分布及患病率風(fēng)險估計(jì) Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)見表1。rs2071480位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)，提示納入的研究樣本符合遺傳平衡狀態(tài)。該樣本的基因頻率可以代表本地區(qū)漢族人群的基因頻率，基因型鑒定正確。

表1 漢族TAP1*rs2071480基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(n)Table 1 Dsitribution of rs2071480 genotype with Hardy-Weinberg test(n)

對照組和AR組的結(jié)果見表2。TAP1 rs2071480基因型分布以GT型最常見，等位基因以G分布頻率最高，病例組與對照組基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示此位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與AR易感性無關(guān)。

NCBI基因庫TAP1 rs2071480位點(diǎn)基因型分布與本研究基因型分布的比較見表3。rs2071480在不同地區(qū)、不同種族間分布存在差異。健康的新疆漢族人群(對照組)與人類多態(tài)性研究中心數(shù)據(jù)庫中漢族人群的分布存在差異(P＜0.05)。

表2 TAP1*rs2071480位點(diǎn)基因型及等位基因分布Table 2 TAP1*rs2071480 genotypes and alleles in the case and control groups

表3 NCBI基因庫與本研究TAP1 rs2071480位點(diǎn)基因型分布Table 3 Distribution of TAP1 rs2071480 gentypes in NCBI and this study

3 討 論

AR是最常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病之一。其發(fā)病率在全球呈逐年增加的趨勢，平均發(fā)病率約為10%～25%［6］。保守估計(jì)全球患者超過5億人［7］，AR已成為了全球性的健康問題［8］。Zhang等［9］對我國11個城市AR電話調(diào)查表明AR患病率約為11%，錢迪等［10］對重慶、成都、烏魯木齊、南寧進(jìn)行的AR流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果AR總患病率為34.31%，其中烏魯木齊AR患病率39.90%，誘因以灰塵和花粉為主，AR發(fā)病狀況在各個地區(qū)均有不同特點(diǎn)。

AR屬于多基因遺傳性疾病，受遺傳和環(huán)境的雙重影響［11］，體外環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致發(fā)病。AR是IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，由Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答失衡而引發(fā)，以鼻腔黏膜Th2細(xì)胞反應(yīng)為主［12］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，遺傳因素可能在AR發(fā)病機(jī)制中起重要作用［13］。國內(nèi)外研究表明AR與MHC基因有關(guān)，HLA－B8、HLA－DR3、DR4、DR7、HLAQ2等可能與AR的發(fā)生有關(guān)［14］。但目前發(fā)現(xiàn)的易感基因并不能解釋AR的所有遺傳特征。

TAP為HLA－Ⅱ類區(qū)抗原處理相關(guān)基因編碼的蛋白，屬于ATP結(jié)合區(qū)(ATP－binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)家族的 B族。TAP基因位于6p21.3，包括TAP1(ABCB2)和TAP2(ABCB3)基因，其編碼產(chǎn)物是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜二聚體，依賴ATP提供的能量TAP分子將細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中經(jīng)過蛋白酶復(fù)合體降解后產(chǎn)生的肽段轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)I類分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的HLA－Ag復(fù)合物，然后表達(dá)于細(xì)胞表面并提呈給細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)［15－16］，產(chǎn)生特異的免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)TAP分子是外源性抗原進(jìn)入內(nèi)源性通道的載體，TAP基因多態(tài)性可以影響抗原的選擇和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而改變免疫應(yīng)答的類型，因而TAP的多態(tài)性在AR的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用［17－19］。已有較多研究證實(shí)，在變態(tài)反應(yīng)病如特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘和自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，TAP1的表達(dá)下調(diào)［20－21］，提示TAP1在此類疾病發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

目前對TAP1基因多態(tài)性與AR的關(guān)系的研究報道較少，在AR發(fā)生中的作用仍有不同觀點(diǎn)。Takheuchi等［22］報道日本人群AR與TAP1基因多態(tài)性無關(guān)。Yilmaz等［23］研究表明在土耳其AR患者的TAP1基因和健康對照組無差異。Ismail等［18］發(fā)現(xiàn)突尼斯人AR與TAP1－637位D等位基因高度相關(guān)。Izakovicová Hollá等［3］研究未發(fā)現(xiàn)捷克人特應(yīng)癥(變應(yīng)性哮喘、AR、變應(yīng)性接觸性皮炎)與TAP1基因多態(tài)性有明顯的相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)TAP1－333分布在病例組與對照組有明顯差異(P＜0.02)。Kim等［24］研究表明TAP1基因與韓國人群患AR有關(guān)聯(lián)。本研究表明，新疆漢族人群TAP rs12071480等位基因及基因型頻率分布在AR組和對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＞0.05)，提示TAP rs12071480可能不是新疆漢族患AR的易感基因。

檢索NCBI的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因庫，TAP1 rs2071480的原始等位基因(ancestral allele)為G，參考等位基因(refSNP alleles)為G/T，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)本研究結(jié)果，新疆地區(qū)健康漢族人群TAP1 rs2071480等位基因及分布與數(shù)據(jù)庫中其他地區(qū)及人群的分布有所不同，并且與內(nèi)地漢族人群分布亦不同，見表3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。我們分析認(rèn)為新疆地處西北，在長期歷史條件下漢族人群與當(dāng)?shù)仄渌褡逋ɑ椴⒉缓币姡?5］，同時受新疆特殊的自然環(huán)境、氣候以及飲食等諸因素影響，因而基因位點(diǎn)呈現(xiàn)不同于內(nèi)地漢族人群的多態(tài)性分布。

基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注［26－27］。本研究未發(fā)現(xiàn)TAP1 rs2071480位點(diǎn)基因多態(tài)性與AR疾病易感性之間有關(guān)聯(lián)，提示此位點(diǎn)可能不是新疆漢族人群患AR的易感基因。由于我們的樣本量尚少，并可能有隨機(jī)誤差，并不能完全排除TAP1 rs2071480位點(diǎn)與AR易感有關(guān)。因此，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步研究和探討TAP1基因其他位點(diǎn)多態(tài)性與新疆漢族人群易患AR的相關(guān)性及AR可能的遺傳易感機(jī)制。

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Relationship between TAP1*rs2071480 gene polymorphisms and allergic rhinitis in the Chinese Han population in Xinjiang

CHEN Qing－yong，YANG Yu－ping，XIANG Yang－bing，TAN Guo－ping，ZHANG Hua
(Department of Otorhinolaryngology，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi830054，Xinjiang，China)

Objective In recent years，more and more attention is being paid to the relationship between transporter associated with antigen processing 1(TAP1)rs2071480 gene polymorphisms and the susceptibility to allergic rhinitis(AR)，and the results vary in different studies.This study aims to investigate the association of TAP1*rs2071480 gene polymorphisms with the predisposition to AR in the Chinese Han population in Xinjiang. Methods We conducted a case control study on the region of TAP1*rs2071480 in 150 Chinese Han people with AR and 150 normal controls using the SNaPshot system. Results The frequencies of TAP1*rs2071480 were consistent with the Hardy－Weinberg equilibrium in both the case and the normal groups.The frequency distributions of three genotypes and two alleles showed no statistically significant differences between the two groups(P＞0.05). Conclusion Maybe TAP1* rs2071480 gene polymorphisms are not associated with the susceptibility to allergic rhinitis in the Chinese Han population in Xinjiang.

TAP1;Single nucleotide polymorphism;Allergic rhinitis;Han population

R765.21

A

1008－8199(2012)08－0805－05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860310)

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科［陳慶勇(醫(yī)學(xué)碩士研究生)、陽玉萍、向陽冰、譚國萍、張 華］

張 華，E－mail:hzhang1106@yahoo.com.cn

2011－11－07;

2012－02－15)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:羅永合)